サイロキシン結合グロブリン遺伝子及びその発現異常に関する分子生物学的研究

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 60480267
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 妹尾 久雄 名大, 環境医学研究所, 助教授 (40135380)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (80174308) ; 松井 信夫 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (50023643)
• Keywords: サイロキシン結合グロブリン / 遺伝子のクローニング / 発現ベクター / 遺伝病 / ジデオキシ法

Research Abstract

1.発現ベクターλgtllに組み込まれたヒト肝cDNAライブラリーを用いたサイロキシン結合グロブリン(TBG)cDNAのクローニング λgtllのEcoRI部位に組み込まれたヒト肝cDNAライブラリー(約2×【10^6】の独立した組換え体)を大腸菌Y1090株に吸着させ、150mm径のプレートに2×【10^4】pfuの濃度で軟寒天と共に培地に重層した。42℃4時間インキュベートした後、10mM IPTGで飽和後乾燥したニトロセルロース(NC)紙を重ね、挿入された遺伝子の産物とβガラクトシターゼとの融合蛋白を2時間誘導、NC紙に吸着せしめた。このNC紙と抗TBG抗体をインキュベーション後、結合した抗TBG抗体をアルカリフォスファターゼ結合抗兎1gGを用いて検出、2万個のコロニーから数個のクローンを得た。この融合蛋白は、精製TBGと抗体結合に競合することからTBGcDNAと固定した。2.TBGcDNAの塩基配列の決定:得られたTBGcDNAクローンのうち最長のインサートをpSP65に再度組み換えし、大量のインサートを得、これをM13バクテリオファージの二重鎖DNAに挿入、ジデオキシ法による塩基配列の決定を開始した。この際、本年度購入した遺伝子情報処理コンピュータが役立っている。3.TBGcDNAによるTBGmRNAの解析:TBG産生肝癌細胞株Hep G2より抽出したRNAをグリオキサール処理し、電気泳動後NC紙に転写(Northern Blotting)、これと【^(32)P】-dCTPで標識したプローベとハイブリダイズさせた。この結果、TBGmRNAは約16Sで、70-80塩基長さの異なる二つのmRNAの存在が確認された。4.健常者、ゲノムTBG遺伝子の構造解析:健常者の抹消血中のリンパ球より採取したDNAを種々の制限酵素により分析後、アガロース電気泳動を行い、これをNC紙に転写後、【^(32)P】-dCTP標識プローベとハイブリダイズした。その結果、TBG遺伝子は一つであること、少なくともHae【III】、BanH【I】、Pvu【II】、Hinf【I】部位の多形性のないことが明らかになった。

Research Products

• [Publications] 妹尾久雄: 環境医学研究所年報. 37. 207-210 (1986)
• [Publications] 安藤通泰: Environmental Medicine. 30. 68-75 (1986)
• [Publications] 神部福司: 環境医学研究所年報. 38. (1987)