TRHreceptor及びそのmRNAの精製に関する研究

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 60570516
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 森 昌朋 群大, 医学部, 助手 (80174382)
• Keywords: TRH / TRHreceptor / mRNA

Research Abstract

ブタ下垂体前葉約20ケを0.32M Sucroseにてhomogenizeした後遠沈後、上清を10,000xg20分間遠沈しその得られた沈澱物を0.5〜5%dizitonicを含む20mM Tris HCl(ph7.5)で約30分間4℃でincubateした後100,000kgで60分間遠沈した。またdigitonuの代わりに同濃度のLubrolを用いて同様の処理を行なった。遠沈し得られた上清を2pmol【^3H】-TPHと共に0℃で90分間incubateした。incubate後20mM Tris-Hclであらかじめ平衡化しておいたSephadix G-50 Sepacol chromatoiolumuに反応液を添加し、100xg2分間遠沈後得られたelutron flurdをカウントした。non specifro反応として1nmolTRHを反応液に加えた。Specifie bouudとしてunlabelled TRHを加えないbsnduy countより上記のunlabelled TRHを加えたbondnyを引く事により求めた。これらの検討によりLubrol乃至はCHAPSによるTRHレセプターの可溶化よりもdigitonicによる可溶化の効率が高く、そのdigitonicの至適濃度は1%であった。このdigitonicにより可溶化されたTRHレセプターとHPLC(ジオールカラムGF-250)にapplyし、各フラクションのピークをTRHレセプターアッセイ乃至は【^3H】カウントすると、2つのフラクションピークを示す事が判明した。この2つのピークの分子量は約240,000と120,000に相当した。小分子ピークは実験条件の差異(例えば温度上昇)により増減を示すので、大分子ピークを示すTRHレセプターの変性物質乃至はサブユニットの可能性が考えられる。現在大分子ピークのTRHレセプターを用いて家兎に免疫を行い抗体作制を実行中である。また慢性甲状腺炎の患者(甲状腺機能低下症を含む)血清より硫安分画により得たIgGフラクションを調制し、TRHレセプター抗体の存在を検索しつつある。