1986 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトトランスコルチンの生合成過程及び遺伝子構造に関する研究
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60570526
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
松井 信夫 名大, 環境医学研究所, 教授 (50023643)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (80174308)
妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (40135380)
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| Keywords | トランスコルチンの糖鎖 / 糖鎖付加阻害 / 糖鎖と分泌 / 糖鎖と分解 / ヒトトランスコルチン / cDNA |
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| Research Abstract |
1)トランスコルチン(Tr)の合成・分泌における糖鎖の役割:ヒト肝癌由来の細胞系HepG2を培養し、confluentな状態に達した時点で、糖鎖付加阻害剤Tunicamycin(TM)5ug/mlを添加し、2時間インキュベートした後、【^(35)S】標職メチオニンで1時間パルスラベルした。パルスラベル終了時、過剰の非標職メチオニンを加えて新たな【^(35)S】の取込を阻止し、0,3,6時間インキュベートした後、細胞および培養液を採取した。対照はTMを加えず、同様の操作を行った。細胞内および培養液中のTrは、抗ヒトTr抗体とパンソルビンで沈殿させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。対照群では、細胞内には分子量56kdのTrが出現し、時間と共に減少したが、培養液中には70kdのTrが出現し時間と共に増加した。一方TM添加により、細胞内に40kdのTrが出現し、そのまま培養液中に分泌されていた。また、細胞内と培養液中のTrの和が、インキュベーションの時間と共に減少した。以上、Trのペプチド鎖の分子量は40kdで、これは細胞内で2段階の糖付加を受けて56kd、70kdと分子量が変化し、70kdになると直ちに分泌されること、また40kdのTrも培養液中に分泌されることから、糖付加はTrの分泌に不可欠でなく、分子の安定性を増すことが示唆された。
2)ヒトトランスコルチンmRNAのcDNA作成経過:ヒト肝から抽出・精製したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、これをバクテリオファージλgt11に組み込んでヒト肝のcDNAライブラリを作成した。次いで抗ヒトトランスコルチン抗体でcDNAライブラリをスクリーニングし、25万個のファージクローンの中から5個のトランスコルチンcDNAを持つファージクローンを得た。現在トランスコルチンcDNAをM13mp18及び19RPに組み込んでその核酸配列を検討中である。
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