1986 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子操作による蛇毒由来トロンビン様酵素の製造法の研究
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60880020
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山科 郁男 京大, 薬学部, 教授 (70025675)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三橋 進 東菱薬品, 大森研究所, 所長代理
菅原 一幸 京都大学, 薬学部, 助手 (60154449)
船越 育男 京都大学, 薬学部, 助手 (10025702)
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| Keywords | 遺伝子 / クローニング / トロンビン様酵素 / アミノ酸配列 / 蛇毒 / プロテアーゼ / 血液凝固 |
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| Research Abstract |
1.B.moojeniの毒腺よりフェノール法により全RNA画分を単離し、オリゴ(dT)セルロース カラム法によりmRNA画分を調製した。得られたmRNAを鋳型にし、二重鎖cDNAを合成し、λgt11DNAをベクターとして、cDNAライブラリーを調製した。
2.トロンビン様酵素のN末端アミノ酸配列に対応する28merの合成DNAをプローブとして、上記のcDNAライブラリーをスクリーニングし、10個の陽性グローンを得た。
3.上記のcDNAインサートのうち、最長(約1,500bp)のcDNAインサートをプラズミドDNApUC13に再クローニングし、cDNAインサートを大量に調製した。このcDNAインサートの塩基配列をM13-サンガー法により決定した。その結果、このcDNAインサートは1523bpよりなり、765bpのオープン リーディング フレームを含むことが明らかになった。
4.トロンビン様酵素より決定されたN末端アミノ酸配列(23アミノ酸残基)と完全に対応する配列が、cDNAより推定されたアミノ酸配列に見出され、このcDNAはトロンビン様酵素cDNAと同定された。
5.cDNAより推定されたアミノ酸配列より、トロンビン様酵素は231アミノ酸残基よりなり、255アミノ酸よりなる生合成前駆体(シグナル ペプチドおよびプロ ペプチドを含む)から生成することが明らかになった。
6.解明されたトロンビン様酵素のアミノ酸配列にはトリプシン,カリクレインなどの哺乳動物由来のセリン プロテアーゼのアミノ酸配列と著しいホモロジーが見出された。また、このホモロジー解析より、トロンビン様酵素の活性残基(His-41,Asp-86,Ser-178)と6対のジスルヒド結合の位置を明らかにした。
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