1986 Fiscal Year Annual Research Report
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61015004
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10168544)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助手 (80088856)
三浦 一伸 北海道大学, 薬学部, 助手 (70001980)
実吉 峯郎 北海道大学, 薬学部, 助教授 (20002339)
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| Keywords | 合成遺伝子 / T4エンドヌクレアーゼ【V】 / 大腸菌トリプトファンプロモーター / チミンダイマー |
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| Research Abstract |
本研究では、DNA修復酵素の一つであるエンドヌクレアーゼ【V】の遺伝子を化学合成し、微生物において酵素を大量に生成させること、また、合成遺伝子を用いることにより任意のアミノ酸を変換した変異体を合成することが可能であるので、エンドヌクレアーゼ【V】の二つの活性部位に変異を導入した変異体を生成させることにより、この酵素の機能を明らかにすることを目的とする。
T4エンドヌクレアーゼ【V】の遺伝子の塩基配列はすでに知られておりcDNAはクローニングされているが、ここでは高発現ベクターに結合する制限酵素認識配列を両末端に持ち、内部に変換用の制限酵素切断配列を持った遺伝子を得るために遺伝子の設計を行った。DNAリガーゼによる結合の際、不都合な結合が生じないように、7塩基以上の繰り返し配列が100塩基以内にはないように、ユドンを変更することによって塩基配列を決定した。138個のアミノ酸に対応する420塩基対からなる二本鎖DNAを26本のオリゴデオキシヌクレオチドに分割した。これらの断片を固相アミダイト法によって、DNA合成機を用いて合成した。これらをDNAリガーゼにより結合し、両末端に設けて制限酵素Sal【I】およびClla【I】部位を用いて発現ベクターpGHL-9に結合し、それを用いて大腸菌をトランスフォームした。合成遺伝子が正しく組み込まれていることをデオキシ法による塩基配列分析で確めた。この発現ベクターのトリプトファンプロモーターをインドールアクリル酸によって誘導することによって遺伝子の発現を行った。
生成した蛋白質をSDS存在のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、期待される分子量を持つことがわかった。また蛋白量は3時間で最大となり、以後減少することが見出された。この酵素はチミンダイマーを含むDNAを切断し、酸可溶物とする活性を示した。
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