遺伝性蓄積性疾患の遺伝子組換えによる治療法の基礎的研究

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 61440044
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 折居 忠夫 岐大, 医学部, 教授 (20045339)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 康之 岐阜大学, 医学部付属病院, 助手 (00163014) ; 祐川 和子 岐阜大学, 医学部, 助手 (60115409) ; 多賀 俊明 岐阜大学, 医学部, 助手 (20144016)
• Keywords: ラットβ-グルクロニダーゼcDNA / ヒトβ-グルクロニダーゼcDNA / イズロネイトスルファターゼの精製 / イズロネイトスルファターゼの単クローン抗体

Research Abstract

1)β-グルクロニダーゼのcDNAの調製
okayama-Berg法の発現ベクターにラットの包皮腺poly【A^+】RNAより合成したcDNAを組み込み、ラットcDNAライブラリーを作製した。当初、抗β-グルクロニダーゼ抗体を用いてこのcDNAライブラリーのスクリーニングを行ったが陽性コロニーは得られなかった。そこでヒトβ-グルクロニダーゼcDNAはPvu【II】-Sst【I】切断端の196bpのみの塩基配列が報告されているので、その中の60塩基よりなるオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてラットcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性コロニーをピックアップした。陽性コロニーから得られたcDNAの制限酵素地図及びサンガー法による塩基配列決定にて、ラットβグルクロニダーゼcDNAのクローンを確認した。
次にヒトβ-グルクロニダーゼcDNAを得るべくヒト胎盤由来のλgtll cDNAライブラリーをスクリーニングし、2個の陽性クローンを得た。その大きさは完全長のものではなかったが、それぞれ2.3kbと1.5kbであった。
上記より現在までにラット及びヒトβ-グルクロニダーゼのcDNAを得、このクローンを利用して完全長の塩基配列を決定しつつ、患児の解析に利用し、また各種のシャトルベクターに取り込み、真核細胞内への導入について検討していく予定である。
2)イズロネイトスルファターゼの精製及び抗体作製
ヒト胎盤より硫安分画.Con-Aセファロースのバッチ法による分画を行ない、ファルマシア製FPLCシステムを用いて、イズロネイトスルファターゼの精製を行ない、DEAEクロマトにて2つのピークが得られ、それぞれ3000倍、1000倍まで精製されたが、SDS-PAGEで単一のバンドにはならなかった。そこでこの部分精製した酵素蛋白を用いてマウスに免疫して、単クローン抗体を作製する予定である。