1986 Fiscal Year Annual Research Report
DNA塩基配列の解析と修飾による新しい酵素タンパクの設計とその応用
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61480057
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
木村 光 京大, 食糧科学研究所, 教授 (80026541)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂口 守彦 京都大学, 食糧科学研究所, 助教授 (00027187)
小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
村田 幸作 京都大学, 食糧科学研究所, 助手 (90142299)
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| Keywords | γ-グルタミルシスティン合成酵素 / グルタチオン合成酵素 / アミノ酸配列 / ジヒドロ葉酸還元酵素 / DNA塩基配列 / 位置特異的点突然変異 |
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| Research Abstract |
大腸菌のグルタチオン合成酵素(GSH-【II】)は、ATP存在下でΥ-グルタミルシスティンとグリシンよりグルタチオン(GSH)を合成する酵素である。この酵素の活性発現に関与しているアミノ酸残基については、未だよく知られていない。そこで、本酵素の構造と触媒機能の関係を明らかにするため、(1)他の酵素のアミノ酸配列との相同性を利用した三次構造の予測、及び(2)位置特異的点突然変異による変異型酵素遺伝子の作製と、その遺伝子産物の触媒特性の解析により、GSH-【II】の活性発現に関与するアミノ酸配列及びアミノ酸残基の効果を検討した。まず、GSH-【II】の三次元構造と機能の関係を解明するため他の種々の酵素のアミノ酸配列との相同性を調べた結果、GSH-【II】のアミノ酸配列は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DFR)のそれと高い相同性を示した。DFRの基質ジヒドロ葉酸及び特異的阻害剤であるメトトレキセートは、極めて低濃度でGSH-【II】活性を阻害し、これらの化合物が特異的にGSH-【II】に結合することが判明した。この結果より、アミノ酸配列の相同性が基質や阻害剤の結合部位や高次構造を解明する有力な手段となると考えられた。GSH-【II】は、4ケのサブユニットより成る分子量16万の酵素で、サブユニット当り4ケのシスティン(Cys)残基(Cys-122,195,222,289)を有する。そこで、4ケのCys残基のコドンをアラニン(Ala)のコドンに変換した変異酵素遺伝子及びCys289コドンをターミナルコドンに変換した変異酵素遺伝子を作製し、GSH-【II】の活性とCys残基の関係を検討した。Cys122とCys222のAlaへの変換は、GSH-【II】活性を夫々50%及び20%低下させた。このことより、Cys122とCys222はGSH【II】の活性発現に必須ではないが、酵素活性の向上に寄与していると推定たれた。その他、γ-グルタミルシスティン合成酵素(GSH-I)遺伝子の翻訳開始コドンTTGを、使用頻度の高いATGに変換することにより、GSH-I遺伝子の翻訳効率を50%高めることが出来た。
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