1986 Fiscal Year Annual Research Report
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61480159
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
高津 聖志 熊本大, 医学部, 教授 (10107055)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原田 登之 熊本大学, 医学部, 助手 (40165022)
富永 明 熊本大学, 医学部, 講師 (50172193)
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| Keywords | B細胞増殖分化因子 / TRF / B151K12 / BCGF【II】 / 抗TRF抗体 / 単クローン抗体 / TRF cDNA / pSP6K-mTRF23 |
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| Research Abstract |
本年度は(【I】)活性化B細胞を抗体産生細胞にまで増殖分化せしめるリンホカインであるTcell replacing factor(TRF)に対する単クローン抗体の作製と、(【II】)TRFをコードするcDNAのクローニングおよびその全構造の決定をした。(【I】)TRF産生TハイブリドーマB151K12の培養上清よりTRFを高度に精製した。方法は硫安塩析法,陽イオンクロマト,等電点分画法,ゲル瀘過法,最後に逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた。精製TRFをラットに免疫しその脾細胞とマウス骨髄腫細胞(P3)とをポリエチレングリコールを用いて融合させHAT培地にて選択した。抗TRF活性はTRF活性阻害能とTRF吸収能によりスクリーニングした。479ウェルの中から1ウェルが抗TRF活性を示したのでクローニングし2つの抗TRF抗体(TB13とNC17)を得た。両抗体ともIg【G_1】クラスであった。両抗体ともB151-TRF活性を完全に阻害するがその他のリンホカインの活性は調べた範囲で抑制しなかった。抗TRF抗体をビーズに結合させたアフィニティカラムを用いるとB151上清中のTRFはすべて吸着し、酢酸溶出によりその活性が回収できた。抗TRF抗体はリコンビナントTRFの活性も完全に阻害した。(【II】)TRFの微量活性測定法およびTRF mRNAを効率よく採取する方法を開発しB151-TRFのmRNAサイズを15〜17Sであると決定した。つづいてアロ抗原反応性株化T細胞2.19のmRNAを鋳型にSP6ベクター系を用いてcDNAライブラリーを作成し、TRF cDNAのクローニングをした。スクリーニングはTRFおよびBCGF【II】活性を指標にした。最終的に得られたTRF.cDNA(pSP6K-mTRF23)は1530個のヌクレオチドより成り、TRFの推定アミノ酸残基数は133個、コアペプチドは112個のアミノ酸残基より成ること、3ケ所のN型糖鎖結合部位を有すること、3ケ所のシステイン残基があり、2量体から成る糖蛋白質であること、リコンビナントTRFはB151-TRFの示す免疫学的特性をすべて示し、その活性は単クローン性抗TRF抗体により完全に阻害された。
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[Publications] Takatsu,K.: Journal of Immunology. 136. 1161-1172 (1986)
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[Publications] Kikuchi,Y.: Journal of Immunology. 136. 3553-3560 (1986)
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[Publications] Tominaga,A.: Microbiology and Immunology. 30. 789-798 (1986)
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[Publications] Kinashi,T.: Nature. 324. 70-73 (1986)
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[Publications] Harada,N.: Proceedings of the National Academy of Sciences,of the U.S.A.
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[Publications] Takatsu,K.: Proceedings of the National Academy of Sciences,of the U.S.A.
