遺伝子工学によるプロラクチン受容体の構造解析及び生理作用発現機構

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 61560296
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 酒井 仙吉 東大, 農学部, 助手 (80114487)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河本 馨 東京大学, 農学部, 助教授 (30011894)
• Keywords: プロラクチン受容体 / プロラクチン / モノクローナル抗体 / 固定化受容体 / ニトロセルロース膜 / スカッチャードプロット

Research Abstract

ウサギの乳腺のミクロゾームに含まれているプロラチン受容体を界面活性剤(Chaps)を用いて可溶化した。この受容体の構造をゲルロ過・超遠心分折・イオン交換クロマト・電気泳動により解折した。プロラクチンと結合する蛋白に二種類あり、それぞれは独立して存在し、等電点も分子量も異なっていた。分子量83,000の受容体は分子量37,000の受容体に比較して約2.2倍多く存在していた。それぞれの精製にスーパーローズ12のゲルロ過が非常に有効であることを明らかにした。もう一段階クロマトフォーカシングで精製した後アフィニテークロマトを行なうと、ほぼ完全に精製される目度がたった。2.000倍に精製したプロラクチン受容体を抗原としてマウスを兎疫し脾臓細胞とミエローマ細胞を融合して、四種類のモノクローナル抗体を得た。いづれの抗体も分子量約15.000の1gGに属し、サブクラスは1gG1と1gG2bであった。この抗体は、受容体に結合してプロラクチンの結合を完全に阻止した。標識した抗体を使って可容化したプロラクチン受容体の性質を調べることは出来ない。そこで可容化した受容体をニトロセルロース膜に固定して用いた。ニトロセルロース膜に固定化された受容体は、ホルモンとの特異性・プロラクチンとの親和性に何の変化もなかった。抗体は、【10^(-9)】Mから【10^(-7)】Mの間で用量反応を示し、高い親和性を持っていた。【10^(-6)】Mで結合は飽和した。この用量反応曲線を用いてスカッチャードプロットにより更に解析を行なった。標識プロラクチン及び標識モノクローナル抗体を用いても、量をかえた非標識モノクローナル抗体により典型的な二相性の反応を示していた。この結果は、モノクロナール抗体を用いても二種類の異なるプロラクチン結合部位が存在することを示しており、生化学的に分析した結果と一致していた。

Research Products

• [Publications] 酒井仙吉: Biochemical Journal. 237. 647-653 (1986)
• [Publications] 佐藤裕保: Journal of Biochemistry. 99. 1639-1643 (1986)
• [Publications] 川村一男: Journal of Biochemistry. 101. 103-110 (1987)
• [Publications] 酒井仙吉: Analyticel Biochemistry. (1987)
• [Publications] 酒井仙吉: Endocrinologica Japonica. (1987)