1986 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳動物の脳神経細胞にのみ発現されている遺伝子の解析
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61570071
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
高橋 豊三 横浜市大, 医学部, 助教授 (40046149)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浜島 健治 横浜市立大学, 医学部, 助手 (00114611)
福島 淳 横浜市立大学, 医学部, 助手 (00181256)
奥田 研爾 横浜市立大学, 医学部, 教授 (40124862)
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| Keywords | サザーンハイブリダイゼーション / ノーザーンハイブリダイゼーション / ウエスターンハイブリダイゼーション / 脳特異的発現 / 哺乳動物の脳 / 非放射性DNA標識 |
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| Research Abstract |
哺乳動物の脳神経細胞にのみ、発現されている遺伝子の解析を行うために必要なcDNAライブラリーの調整を行ってきた。まず、大脳皮質よりグアニジンチオチアネート法によりtotal RNAを抽出し、さらにoligo-dTセルロースカラムクロマトグラフィーでpoly(A)【^+RNA】を分離した。この一部をウサギ網状赤血球ライセートエを用いたin vitroトランスレーション法によりmRNAの活性の測定を行った。次に、このmRNAを用いてGubler法を一部改変してds-cDNAの合成を行った。得られたcDNAの一部を用い、アガロースゲル電気泳動を行いSouther〓トランスファーの後、オートラジオグラムをとり、0.5〜6.5Kb程度のサイズのcDNAが合成されていることを確認した。
こうして得られたds-cDNAをクローニングベクターであるλgt11に挿入するために、【T_4】ポリメラーゼにより平滑末端にしたのち、【T_4】リガーゼを利用してEcoRIリンカーを接続した。さらにEcoRIメチラーゼを用い、EcoRI部位のメチレーション反応を行いcDNA内のEcoRI部位を修飾しEcoRIによるcDNA内の切断を不能にした。次にEcoRIで酵素反応を行った。反応後、熱処理にて酵素を不活化し、Bio Gel A50m(100-200メッシュ)によるゲルクロマトグラフィーにより600塩基対以上のcDNAを集めた。一方、λgt11DNAをEcoRIで切断し、【5!'】側の脱リン酸化を行ったものを用意した。このEcoRIで切断したλgt11DNAと分画したcDNAを1:2の比率で混合し、【T_4】リガーゼの反応下でアニーリングを行った。さらにin vitroパッケージングを行い、ファージを大腸菌に感染させた後、プレートにまきX-galとIPTGによるスクリーニングを行った。その結果、2〜3×【10^6】個のcDNAライブラリーができていることが確認された。
今後、脳に特異的に反応する抗体や合成DNAを用い、これらのcDNAライブラリーから脳に特異的なcDNAをクローニングする予定である。
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[Publications] TAKAHASHI,T.;Ishii,N.;Aoki,I.;K.Okuda: Can.J.Med.Tech.48. 161-163 (1986)
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[Publications] TAKAHASHI,T.;Mitsuda,T.;Hikawa,N.;Ishii,N.;K.Okuda.: Can.J.Med.Tech.48. 216-218 (1986)
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[Publications] ISHII,N.;Nakajima,H.;Aoki,I.;Ishii,T.;Takahashi,T.K.Okuda.: Immunogenetics. 23. 351-356 (1986)
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[Publications] ISHII,N.;Kawaguchi,H.;Ishii,T.;Aoki,I.;Okuda,K.;Takahashi,T.;Nakajima,H.: Yokohama Med.Bull.37. 21-27 (1986)
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[Publications] Ishii,N.;Kawaguchi,H.;Aoki,I.;Ishii,T.;Mistuda,T.;Takahashi,T.;H.Nakajima: Yokohama Med.Bull.37. 15-20 (1986)
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[Publications] 高橋豊三,満田年宏,萩屋道雄,坂野仁,奥田研爾: 横浜医学. 38. (1987)
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[Publications] 高橋豊三,重松貴: "放射性同位元素を使わないPhot〓bi〓tin法(上)(下);あなたにもできる遺伝子診断(バイオインダストリー)" シーエムシー社, 18 (1986)
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[Publications] 高橋豊三,満田年宏,奥田研爾: "DNAプローブによる感染症の直接診断(1)(2)(3)(4)" シーエムシー社, 60 (1986)
