組換えDNA技術を用いた第二世代日本脳炎ワクチンの開発

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 61870025
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 五十嵐 章 長崎大, 熱帯医学研究所, 教授 (40029773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤田 弘之 財団法人阪大微生物病研究会, 観音寺研究所, 生物工学センター主任 (30156880) ; 高木 光生 財団法人阪大微生物病研究会, 観音寺研究所, 技術部次長 (60113453) ; 吉田 厳 財団法人阪大微生物病研究会, 観音寺研究所, 品質管理部長 (60072782) ; 住吉 日出夫 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助手 (80179308) ; 榊 佳之 九州大学, 遺伝情報実験施設, 教授 (10112327)
• Keywords: 日本脳炎ウイルス / 組換DNA / ワクチン / 遺伝子RNA / 塩基配列解析

Research Abstract

日本脳炎ウイルス野性株の一つJaOArS982株をヒトスジシマカ培養細胞クローンC6/36で増殖し、濃縮精製ウイルスから抽出したRNAを鋳型として一本鎖cDNA次いで二本鎖cDNAを合成し、大腸菌プラスミドpVC又はpBR322にクローニングし大腸菌を形質転換した。長いcDNAを含むクローンを塩基配列の決定に用い、各クローンの解析結果を総合してウイルスRNAの中央部の塩基配列を求めた。ウイルスRNAの5'末端構造は5'末端に近いクローンの塩基配列を基に作成したプライマーを用いたプライマー延長法と、感染細胞中に存在する二本鎖RNAの末端を標識してwondering spot法から求めた。ウイルスRNAの3'末端構造はウイルスRNAにpoly Aを付加し、ol igo dTをプライマーとして得られた複数のクローンが同一の塩基配列を示した事と、その配列が既に発表されている他のフラビウイルスである黄熱及び西ナイルウイルスのそれと類似の二次構造を取る事からウイルスRNAの3'末端構造であると推定した。これらの結果を総合したところ、日本脳炎の遺伝子RNAは10976個の塩基より成り、5'末端の95塩基はnoncoding regionで、最初のATGに始まる10296塩基がopen reading frame(ORF)を形成し、それに続く585塩基が3'末端non-coding regionを形成していることが判明した。ORFによって決定されるタンパクは分子量380162のpolyproteinであると推定されるが、それに相当するものは感染細胞中に見られないのでウイルスタンパクは合成と共に速やかに加水分解されて最終産物になると推定される。ORFの中でN末端(塩基配列では5')に近い約3分の1はウイルス粒子を形成するタンパクであるV2(C)、PreM(V1(M)の前駆体)、V3(E)を決定する遺伝子がこの順序で配列している事がタンパクのN末端アミノ酸配列結果から推定された。感染防御に最も重要な外被膜糖タンパクV3(E)を酵母菌発現vectorに挿入し酵母菌に感染したところV3(E)と類似のタンパクが形成された。

Research Products

• [Publications] Sumiyoshi,H.;Morita,K.;Mori,C.;Fuke,I.;Shiba,T.;Sakaki,Y.;Igarashi,A.: Gene. 48. 195-201 (1986)
• [Publications] rashi,A.Fujita,H.;Sumiyoshi,H.;Mori,C.;Manabe,S.;Takagi,M.;Yoshida,I.;Morita,K.;Fuke,I.;Fukai,K.;Igar: Bulletin of the World Health Organization. (1986)
• [Publications] Sumiyoshi,H.;Mori,C.;Fuke,I.;Morita,K.;Kondou,J.;Kikuchi,Y.;Nagamatsu,H.;Igarashi,A.: Virology. (1986)
• [Publications] 五十嵐章,住吉日出夫: 実験医学. (1986)