天然基質を用いた蛋白質チロシンキナーゼの活性測定法の開発

1986 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 61880017
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 武田 誠郎 広島大, 医学部, 教授 (40030853)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 碓井 裕文 広島大学, 医学部, 講師 (40127618)
• Keywords: 蛋白質チロシンキナーゼ / チュブリン / 蛋白質チロシン残基のリン酸化 / チロシンキナーゼ / 蛋白質のリン酸化 / SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 / 代謝調節 / 細胞情報伝達

Research Abstract

従来蛋白質チロシンキナーゼの活性測定には基質としてセリン及びトレオニンを含まないチロシンを含んだぺプチド又はグルタミン酸とチロシンのペプチド重合体が用いられて来たが、チロシンキナーゼの生理的意義及びその活性調節機構の解明には天然基質を用いたこの酵素の活性測定法の開発の必要性を感じチュブリンを用いた活性測定法を開発した。
1.基質の調製;ウシ全脳よりチュブリンを抽出し、硫安分画,DEAE-Sephadex,ゲル濾過、【Mg^(2+)】とGTPによる重合,遠沈,透析により可溶化した。混入するセリン、トレオニンプロテインキナーゼは60℃,2分の緩和な熱処理で失活させた。
2.チュブリンのチロシン残基のリン酸化の測定;ATP-γ-【^(32)P】と粗酵素標品によりチュブリンのセリン,トレオニン,チロシンのいづれもがリン酸化される場合は反応をSDS,2-メルカプトエタノールを含む緩衝液を加え加熱して止め、反応液をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、リン酸化されたチュブリンを他の成分から分離した。染色したチュブリンバンドを切り取り、セレンコフ効果によりチュブリンに取り込まれた【^(32)P】を測定し、総リン酸量を算出した。次にこのゲルをアルカリで加熱し、遊離する【^(32)Pi】をリンモリブデン酸とし、イソブタノール-ベンゼン層に抽出し計測した。このアルカリ処理の条件設定はセリンのみがリン酸化されたチュブリンとチロシンだけがリン酸化されたチュブリンを用いて行った。アルカリ処理はセリン、トレオニンに結合したリン酸の方がチロシンに結合したリン酸より不安定である性質を利用したものでチロシンのリン酸の分別定量に用いた。純化された酵素でチロシンのみがリン酸化される場合はトリクロロ酢酸で皮応を止めリン酸化されたチュブリンを濾紙にスポットするか、グラスフィルターでこして【^(32)P】を測定する方法を確立した。

Research Products

• [Publications] Hirofumi Usui: FFBS Letters. 184. 60-64 (1985)
• [Publications] Kazunori Yoshikawa: Journal of Biological Chemistry. 260. 15091-15099 (1985)
• [Publications] Haruhisa Tsukamoto: Journal of Biological Chemistry. 262. (1987)
• [Publications] Hirofumi Usui: "Cellular Regulation and Malignant Growth" Japan Sci.Soc.Press,Tokyo/Springer-Verlag,Berlin, 503 (1985)