遺伝子発現におけるRNAスプライシングの分子生物学的研究

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62065009
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 志村 令郎 京都大学, 理学部, 教授 (60025426)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡田 清孝 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所・細胞生物学研究系, 助手 (50101093) ; 坂本 博 京都大学, 理学部, 助手 (00187048) ; 安田 国雄 京都大学, 理学部, 助教授 (30025473)
• Keywords: mRNA前駆体スプライシング反応 / 第二段階反応 / ATP要求性 / 核内キャップ構造認識因子 / 卵母細胞 / RNaseP-RNA成分 / 二次構造 / 部位特異的突然変異体生成法

Research Abstract

前年度までに確立していたδ-クリスタリン遺伝子の断片から、in vitro系で転写合成したメッセンジャーRMA前駆体(pre-mRNA)と、HeLa細胞の核抽出液を用いたin vitroスプライシング反応系を用いて、スプライシング反応の第二段階、すなわちラリアットイントロン-エキソンRNA分子の3'スプライス部位の切断と、二つのエキソン配列の連結の反応から成る段階にも、ATPが必須であることを明確にした。一方、昨年度までの研究でin vitroスプライシング反応系において、pre-mRNAの5'末端に存在するキャップ構造がスプライシング反応を促進すること、またその促進効果は、pre-mRNAがイントロンを2個含む場合は、キャップ構造に近い方のイントロンのスプライシングのみ及ぼされることを示したが、このような促進効果は、キャップ構造を特異的に認識する因子が関与すると考え、この因子をHeLa核抽出液中に探索した。この過程で、キャップ構造をもつRNAをプローブとするゲルシフト法を開発し、この手法を用いて上記の因子を同定し、種々のクロマトグラフィーによって単一成分にまで精製した。この因子は、分子量が約8万ダルトンの蛋白質であった。一方、上記のキャップ構造の効果をアフリカツメガエルの卵母細胞にpre-mRNAを微注入することによって検討した。キャップ構造をもたないRNAの核内での不安定性を克服するために、ApppGをプライマーとして合成したpre-mRNAを採用し、キャップ構造が、細胞中でもスプライシングに促進効果をもつことを証明した。
一方、触媒活性をもつRNase PのRNA成分について、tRNA前駆体の切断活性をもつドメインを明らかにするため、効率のよい部位特異的突然変異生成法を開発した。また化学修飾法によってこのRNA分子の二次構造を明らかにし、触媒活性をもつ領域を明確にした。

Research Products

• [Publications] Sawa,H: Nucleic Acids Research. 16. 3157-3164 (1988)
• [Publications] Shiraishi,H.: Gene. 74. 313-319 (1988)
• [Publications] Shiraishi,H.: EMBO Journal. 7. 3817-3821 (1988)
• [Publications] Shimura,Y.: Methods in Enzymology.
• [Publications] Ohno,M.: Methods in Enzymology.
• [Publications] Komaki,M.K.: Development. 104. 195-203 (1988)