殺虫性タンパク質δー内毒素遺伝子の解析と活性の改変

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62470120
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 駒野 徹 京都大学, 農学部, 教授 (30026413)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植田 和光 京都大学, 農学部, 助手 (10151789) ; 山野 好章 京都大学, 農学部, 助手 (00182593) ; 酒井 裕 京都大学, 農学部, 助教授 (60089117)
• Keywords: 殺虫性タンパク質 / δーエンドトキシン / Bacillus thuringiensis var israelensisの殺虫性タンパク質 / 130kDaタンパク質遺伝子 / BTIの殺虫性タンパク質遺伝子

Research Abstract

1.Bacillus thuringiensis var israelensis の産生する双翅目昆虫に対して強い殺虫性を示すδー内毒素は分子量130kDaの巨大分子であり、このタンパク質の殺虫活性ドメインを決定するとともに、より活性の高いタンパク質の構築を行なうことを目的とする。
2.pUC19のβーガラクトシダーゼ遺伝子と、130kDaタンパク質をコードする遺伝子を有すISRH4のNー末端29アミノ酸を除いた全長を融合して、融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。融合タンパク質はCBB染色によってバンドとして検出された。また Protein immunoblotによっても検出された。部分精製して得られた融合タンパク質は、蚊の幼虫に対する殺虫性を示した。
3.上記の融合タンパク質遺伝子をCー末端から順次欠失させ、12個の欠失遺伝子を作製した。これらの遺伝子を大腸菌内で発現させ、Protein immunoblotによって検出を試みた。Cー末端を欠失するにつれてimmunoreactivity を失った。融合によって生成したβーガラクトシダーゼ活性を測定し、間接的にタンパク質の検出を試みたところこれら欠失変異タンパク質の殺虫活性部位は、ISRH4タンパク質においては少なくとも30番目から695番目のアミノ酸の間に存在することが明らかとなった。
4.枯草菌で二種類の130kDaタンパク質遺伝子(ISRH3、ISRH4)を発現させた。発現はProtein immunoblotによって確認した。2つの遺伝子はBTI自身のプロモーターから転写されたものと考えられ、発現量は胞子形成期に若干増加する傾向を示した。枯草菌で作られた二種類のタンパク質は、大腸菌の場合と同様、蚊の幼虫に対して殺虫性を示した。
5.欠失変異遺伝子の発現により、殺虫性活性トメインを決定するとともに、タンパク質工学的に改変し、より活性の向上を目差す。

Research Products

• [Publications] Kikuo,Sen: Agric.Biol.Chem.52. 873-878 (1988)
• [Publications] Kikuo,Sen: Agric.Biol Chem.52. 1593-1595 (1989)
• [Publications] Kikuo,Sen: Mem Coll.Agric Kyoto Univ.133. 13-22 (1989)