ユビキノン生産酵素遺伝子のクローニングとその大腸菌における形質発現

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62560106
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 松田 英幸 島根大学, 農学部, 教授 (50032595)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 落合 英夫 島根大学, 農学部, 教授 (10032971) ; 森 忠洋 島根大学, 農学部, 教授 (20166359) ; 川向 誠 島根大学, 農学部, 助教授 (70186138)
• Keywords: ユビキノン-10 / ユビキノン生産酵素 / p-hydroxybenzoate-polypernylpyrophosphate-transferase / ubiA遺伝子 / 光合成細菌のユビキノン

Research Abstract

1.ユビキノン(UQ)生合成のKey enzymeであるp-Hydroxybenzoate(PH8)-Polypernylpyrophosphate(PPP)-TransferaseをコードしているubiA遺伝子は、大腸菌のGene BankからubiA周辺領域を含むファージDNAを抽出して単離した。その制限酵素切断断片をpUC18につなぎ、E.coli JM109にTransformationしX-gal、アンピシリンプレートで選択した。その結果外来遺伝子がクローニングされているコロニーを得、それらのプラスミドを制限酵素で切断しubiA領域の既知切断サイトと比較し、ubiA遺伝子の挿入を確認して、このプラスミドをpUBAとなずけた。
2.このpUBAをubiA欠損変異株E.coli AN385にTransformationし、その菌体成分をTLC,HPLCで分析すると、UQ-8が明瞭に検出され挿入されたubiA遺伝子の大腸菌における形質発現が認められた。
3.ubiA遺伝子にコードされているTransferaseは基質特異生が広いのでこの遺伝子を光合成細菌に導入し発現させると有用なUQ-10のみの高生産優良株の育種が期待できる。そこで光合成細菌への形質転換系の確立のため、光合成細菌R.Snheroides KA38を広域宿主ベクターRSF1010(Sm^r,Su^r)でTransformationした。形質転換体からプラスミドを抽出しRSF1010の存在を確認し、形質転換系の基礎が確立できた。
4.遺伝子の光合成細菌への形質転換効率をあげるため、電気パルス法による遺伝子導入法について検討した。その予備実権として、プラスミドpUBAの大腸菌E.coli IM109への形質転換効率を検討した。その結果、4.95KV/cmで生細胞当り約15倍の転換効率が得られた。
5.上記の結果、ubiA遺伝子のクローン化に成功し、そして光合成細菌への形質転換系が確立された。ubiA遺伝子をRSF1010に組換え新マーカーを付与し電気パルス法によって光合成細菌へ導入して、UQ-10のみの高生産優良株の育種と効率的生産システムの検討を進めている。