ヒト血小板膜糖蛋白GPIbのトロンビンレセプターのcDNAクローニング

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62570557
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 田上 憲次郎 (財)東京都臨床医学総合研究所, 循環器病研究部門, 部長 (30014137)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大野 茂男 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報部, 研究員 (10142027) ; 片桐 康博 東京都臨床医学総合研究所, 循環器病研究部門, 研究員 (60194768) ; 赤松 紀子 東京都臨床医学総合研究所, 循環器病研究部門, 研究員 (30124431) ; 北川 恒代 東京都臨床医学総合研究所, 循環器病研究部門, 研究員 (70124451) ; 山崎 博男 東京都臨床医学総合研究所, 副所長 (50013826)
• Keywords: 血小板膜糖蛋白GPIb / トロンビン結合部位

Research Abstract

HEL細胞をTPA(25ng/ml)の存在下24時間培養、培地交換後TPA-フリーの培地でさらに44時間培養した後の細胞ではGPIbの発現を確認したので、TPA-free培地での24時間培養後の細胞から型の如く全RNA画分、ついでpoly(A)RNAを抽出し、2本鎖cDNAを作成した。これをλgt10のベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作成した。既に報告されたデータをもとに合成プローブを作成して使用し、5個のpositiveなクローン(0.7-1.7kb)を得て、pUC18を用いたsubcloningおよびsequenceを施行したが、いずれも陽性の成績は得られなかった。無核の血小板においても若干の蛋白合成が行なわれているとの報告があり、大量の血小板を収集して、これからmRNAを抽出して、同様にcDNAクローニングを試みたが、成功しなかった。
GPIba鎖のN末端側の40kDaのfragment内のS-S loop付近にトロンビン結合部位の存在が想定されてきたが、この解明のため、Lopezらの報告に基ずいてこの領域(アミノ酸番号#181-306)の11-28個のアノ酸残基から成る11種のペプチドを合成し、ヒト洗浄血小板を0.02U/mlトロンビンで刺激時の、これらのペプチドの凝集抑制活性を測定した。ペプチドFT25(#216-240の25個アミノ酸残基より成る、以下同様)は最大の抑制効果(IC_<50>=12μM)を示した。この領域の他のペプチドDK28(#235-262)、DD26(#249-274)、GA24(#268-291)のIC_<50>はそれぞれ68、73、115μMであった。他方、この領域外のペプチド、例えばEP26(#181-206)、ETP26(#281-306)などのIC_<50>は500μM以上であった。しかし、この領域内のアミノ酸残基数が20個以下のペプチドはVK18(#236-253)も含めて、抑制活性を示さなかった。トロンビンのGPIb上の結合部位はFT25を中心にして、広い部分にわたっているようであり、しかもその生理活性の発現にはアミノ酸残基数にして24個以上を要するように考えられた。

Research Products

• [Publications] Kitagawa,H.,;Yamamoto.N.,;Yamamoto,K.,;Tanoue,K.,;Kosaki,G.,;Yamazaki,H.: Cancer Res.49. 537-541 (1989)
• [Publications] Jung.S.M.,;Yoshida,N.,;Aoki,N.,;Tanoue,K.,;Yamazaki,H.,;Moroi,M.: Blood. 71. 915-922 (1988)
• [Publications] Tanoue,K.,;Yamamoto.K.,;Yamamoto,N.,;Suzuki,H.,;Kitagawa,H..;Yamaguchi,A.: Acta Haematologica Japonica.50. 1714-1722 (1987)
• [Publications] Tanoue,K.,;Hasegawa,S.,;Yamaguchi,A.,;Yamamoto,N.,;Yamazaki,H.: Thrombosis Research. 47. 323-333 (1987)
• [Publications] Suzuki,H.,;Yamamoto,N.,;Tanoue,K.,;Yamazaki,H.: Histochem.J.19. 125-136 (1987)
• [Publications] 田上憲次郎、山本正雅、北川恒代、山本一夫、鈴木英紀、山崎博男: 日本血液学会雑誌. 50. 706-711 (1987)