コンリアセチルトランスフェレーズのcDNAクローニングとその遺伝子発現機構の解析

1987 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62571007
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
• Principal Investigator: 石田 功 (財)東京都神経科学総合研究所, 主任研究員 (10142150)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 横山 恵美子 (財)東京都神経科学総合研究所, 主事研究員 (10150195)
• Keywords: コリンアセチル転移酵素 / 組換えDNA / 運動ニューロン

Research Abstract

我々は最近ウシ脳の線条体よりコリンアセチル転移酵素(ChAT)を部分精製したのちマウスを免疫し, 単クローン抗体を3種樹立することに成功したが, 本年度はこの抗体を用いて以下の研究を進めた.
(1)ChAT蛋白質の精製とアミノ酸配列の解析:上記単クローン抗体をセフアローズに結合してイムノアフィニティークロマトグラフィを作成した. ウシ脳の線条体よりChATを部分精製したのちイムノアフィニティカラムに吸着させ, Tris-HCI暖衡液で洗浄後NaClとUreaによってChATを溶出した. この段階でChATはほゞ純品に近い状態であったが, 微量の混入蛋白質を除くためさらにSDS電気泳動により68KDaのChATを分離溶出した. そのアミノ酸配列を決定するためChAT蛋白をトリプシンやリジンエンドペプチターゼで分解し, 逆層液体クロマトグラフィーにより蛋白質断片を分離する条件を検討中である.
(2)ChATのcDNAクローニング:我々が作成した単クローン抗体SDSで変性したChATを認識するので, この抗体を用いてcDNAクローニングを行っている. すなわち, ウシ脊髄前角のPoly(A)^+RNAより二重鎖cDNAを調整し, これを発現ベクターλgtll11に組み込んだのちcDNAライブラリーを作成し, 単クローン抗体でスクリーニングした. その結果7個の陽性クローンを得たがこのうち3クローンは免疫反応が強くお互いに交叉すること, またノーザンブロットでは脳と脊髄に特異的であることから, ChATのcDNAの可能性が大きいと考えられる. このクローンについて制限酵素マップを作成し, 塩基配列も一部決定した. (1)の結果と合わせてこれがChATのcDNAであるかどうかが明らかになるであろう.

Research Products

• [Publications] Tomohuki Ichikawa, Isao Ishida, Yukio Hirata and Takeo Deguchi: Neuroscience Letters. 81. 24-28 (1987)
• [Publications] Isao Isaida,*Tomoyuki Ichikwa,and Takeo Deguchi: Journal of Neurochemisy. 49. 933-938 (1987)
• [Publications] 石田功,市川友行: 神経研究の進歩. 31. 223-240 (1987)
• [Publications] 石田功,市川友行,石井加代子,出口武夫: 神経化学. 26. 160-162 (1987)