非水溶媒中での酵素機能発現とその応用

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63470068
• Research Institution: Tsukuba University
• Principal Investigator: 木瀬 秀夫 筑波大学, 物質工学系, 助教授 (20013170)
• Keywords: プロテア-ゼ / エステル合成 / ペプチド合成 / 加水分解 / 溶媒効果 / 基質特異性 / 立体特異性 / 固定化

Research Abstract

有機溶媒中、特に親水性有機溶媒中でのプロテア-ゼによるアミノ酸誘導体のエステル合成、エステル交換、及びペプチド合成反応の動力学的研究からその特性を明らかにすると共に、酵素の固定化による活性と特異性の変化を明らかにする目的で研究を行ない、以下の結果を得た。
すなわち、従来酵素反応には不適とされていたアルコ-ル、アセトニトリル、アセトン等の水と混和性の有機溶媒中において、上記の諸反応に対してα-キモトリプシン、スプチリシンなどのプロテア-ゼが高い活性を示すことを見いだした。特にスプチリシンCarlsbergは少量の水を含むエタノ-ル中に溶解するにもかかわらず高い活性を発現した。反応はミカエリス-メンテン型の動力学に従い、各動力学パラメ-タの比較からエステル化とエステル交換反応においては、酵素のアシル化と脱アシル化がそれぞれ律速であると推定された。また水溶液中と比較して、有機溶媒中では酵素-基質間の疏水性相互作用の比重が低下すると考えられる結果を得た。これらのプロテア-ゼは、縮合及び置換反応によるペプチド合成に対しても高い活性を示したが、水溶液中と比較して基質特異性に変化が認められた。
一方、キチン、キトサン、橋掛けキトサン、およびPVA-キトサンブレンドフィルム等に固定化したプロテア-ゼによるエステル化、エステル交換反応の動力学的研究から、これらの担体が有機溶媒中で酵素-基質の結合過程ばかりでなく、触媒過程に対しても大きな影響を与えることが見いだされた。これらの結果は、溶媒及び固定化担体の選択により、酵素の触媒活性ばかりでなく特異性のコントロ-ルが可能であることを示している。

Research Products

• [Publications] Hidetaka Noritomi: "Enzymatic Reactions in Aqueous-Organic Media VII.Peptide and Ester Synthesis in Organic Solvents by α-Chymotrypsion Immobilized through Non-Covalent Binding to Poly(vinyl alcohol)" Polymer Journal. 21. 147-153 (1989)
• [Publications] Hideo Kise: "Difference in Catalytic Activities of Subtilisin Carlsberg and Subtilisin BPN'and Immobilization-Activation for Ester Synthesis and Transesterification in Ethanol" Bioorganic Chemistry. 18. (1990)
• [Publications] Hideo Kise: "Protease-catalyzed Synthetic Reactions and Immobilization-Activation of the Enzymes in Hydrophilic Organic Solvents" Journal of Biotechnology. (1990)
• [Publications] Hideo Kise: "Ester and Peptide Synthesis by Proteases Immobilized to Cross-linked Chitosan Beads"
• [Publications] Akira Watanabe: "Ester and Peptide Synthesis by Proteases Entrapped to PVA or PVA-Chitosan Films"
• [Publications] Hideo Kise: "Solvent Effect on the Substrate-and Stereo-specificities of Proteases for Hydrolytic and Synthetic Reactions"