インスリン受容体キナ-ゼの細胞内基質蛋白・pp185の純化とcDNAクロ-ニング

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63480266
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 春日 雅人 東京大学, 医学部(病), 講師 (50161047)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 紘一 東京都臨床医学総合研究所, 部長 ; 泉 哲郎 東京大学, 医学部(病), 医員 (00212952) ; 柴崎 芳一 東京大学, 医学部(病), 助手 (80196419)
• Keywords: 抗燐酸化チロシン抗体 / モノクロナル抗体

Research Abstract

インスリン受容体キナ-ゼの細胞内基質蛋白であるpp185の純化を試みるにあたって、まずモノクロナル抗体を作製することとした。ラット肝癌由来細胞株であるH-35細胞を2000dish(φ10cm)培養し、インスリン刺激後、細胞を可溶化して、抗燐酸チロシン抗体アフィニティカラムで純化した。この分画をSDS-PAGEにて分離後、分離した蛋白をニトロセルロ-スシ-トに転移し、分子量185,000の部位のみ切り出し、細く砕いた後、マウスに免役した。このような試みを合計3回行ったが、残念ながらpp185に対するモノクロナル抗体は得られなかった。その原因としては、(1)ラットの細胞を用いたため、ラットpp185はマウスに対して抗原性が乏しかった。(2)免役したpp185の蛋白量が乏しかった。などが考えられた。これらの点を克服するために、(1)ヒト肝癌由来細胞株であるHcpG2細胞を用いる。(2)より容量の大きい抗燐酸化チロリン抗体アフィニティカラムを用いる。という二点を最大の改良点として、再度pp185に対するモノクロナル抗体の作製を試みている。今回の改良法により、pp185に対するモノクロナル抗体が得られるかどうかは未だ不明であり、現在の所はっきりした成績はない。もしモロクロナル抗体がうまく得られれば、これらのモノクロナル抗体を用いてイムノアフィニティカラムを作製する予定である。pp185の純化にはこれらのイムノアフィニティカラムが強力な武器となることは十分創造されるところであり、純化のためにはモノクロナル抗体が必要不可欠と考えられる。

Research Products

• [Publications] Takayama-Hasumi,S.,Tobe,K.,Momomura,K.,Koshio,O.,Tashiro-Hashimoto,Y.,Akanuma,Y.,Hirata,Y.,Takaku,F.,and Kasuga,M.: "Autoantibodies to the insulin receptor(B-10)can stimulate tyrosine phosphorylation of the β-subunit of the insulin receptor and a 185,000 MW protein in rat hapatoma cells." (J.Clin.Endocrinol.Metab.). 68. 787-795 (1989)
• [Publications] Tashiro-Hashimoto,Y.,Tobe,K.,Koshio,O.,Izumi,T.,Takaku,F.,Akanuma,Y.,and Kasuga.M.: "Tyrosine-phosphorylation of pp185 by insulin receptor kinase in a cell-free system." (J.Biol.Chem.). 264. 6879-6885 (1989)
• [Publications] Tobe,K.,Koshio,O.,Tashiro-Hashimoto,Y.,Takaku,F.,Akanuma,Y.,and Kasuga.M.: "Immunological detection of phosphotyrosine-containing proteins in rat livers following insulin injection." (Diabetes). (1989)