遺伝子導入を用いたサイロキシン結合グロブリン糖鎖の生理学的役割に関する研究

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63480268
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (40135380)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松井 信夫 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (50023643) ; 村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (80174308)
• Keywords: サイロキシン結合グロブリン / 遺伝子 / 糖鎖 / 部位特異的突然変異

Research Abstract

1. 正常及び異常TBG症患者のゲノムTBG遺伝子のクローニング
正常及びサイロキシン(T4)結合能の損なわれた異常TBG症患者の末梢白血球からDNAを抽出、制限酵素EcoRlを用いて完全に消化後、DNAをバクテリオファージEMBL4のDNAに組み込み、in vitroでパッケージングし、宿主細胞LE392(大腸菌K12株由来)に感染させ、ゲノムDNAライブラリーを作成した。このライブラリーを、既にクローニングしたTBG cDNAを用いてスクリーニングし、ゲノムTBG遺伝子をクローニングした。更にM1.3バクテリオファージを用いてエキソン部分の塩基配列を決定した。
2. キメラTBG遺伝子の作成と真核細胞発現ベクターへの組み込み
当初の計画ではゲノム遺伝子を直接COS-1細胞に導入し、発現されたTBGの物理生化学的正常を検討することにより、TBGの糖鎖の役割を検討する予定であった。しかしながら効率よくTBG遺伝子を発現するためには強力なプロモーターの下流に構造遺伝子を挿入してCOSー1に導入した方が良いと考えられた。従って、我々のクローニングしたTBGcDNA(λcTBGna)に欠けいてる5'末端の塩基配列を正常ゲノムDNAより切り出し、これとλcTBGnaを結合して、キメラTBG構造遺伝子を作成し、これを真核細胞発現ベクターpSV2に組み込み、COS-1細胞に導入した。この結果TBG cDNAとハイブリタイズするmRNAが効率よく発現されることがNorthern blot法により確認された。しかしながら、TBGそのものの培養液中への分泌は認められず、エキソンIの5'上流の配列が構造遺伝子に含まれていたことが、正常のTBG mRNAの生成を妨げていることが示唆された。今後翻訳領域のみを有するTBG構造遺伝子を作成し、TBGの合成・分泌、生理活性に果たす糖鎖の役割を研究したい。

Research Products

• [Publications] Fukushi Kambe: Molecular Endocrinology. 2. 181-185 (1988)
• [Publications] Yuichi Mori: J.Clin.Endocrinol.Metab.(1988)
• [Publications] K.Takeda: J.Clin.Invest.(1988)
• [Publications] 妹尾久雄: Common Diseae Series甲状腺疾患、南江堂. (1988)
• [Publications] 神部福司: 環境医学研究所年報. (1988)