細胞毒素蛋白質リシンA鎖の基質RNAに対する特異性の決定と、その機能構造の改変

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63480492
• Research Institution: 山梨医科大学
• Principal Investigator: 遠藤 弥重太 山梨医科大学, 医学部生化学第二教室, 助教授 (40093843)
• Keywords: 細胞毒素蛋白質 / リシンA鎖 / αーサルシン / リボソ-ムRNA / 毒素ドメイン / RNANーグリコシダ-ゼ / RNAオリゴマ- / リボソ-ム

Research Abstract

1、リシンA鎖の基質特異性の決定
細胞毒素蛋白質、リシンA鎖はユニ-クな酵素“RNA Nーグリコシダ-ゼ"であって、rRNA鎖中の一個のNーグリコシド結合を特異的に水解し、リボソ-ムを不活性化する。リシンの作用部位は、28SrRNAの5末端から4324番目のアデノシン残基で、この部位は31塩基より成るステムル-プ構造(毒素ドメイン)内に位置している。本研究は、リシンの酵素反応機構を明らかにする目的で、毒素ドメインを模した50種類の合成RNAオリゴマ-を合成し、これを基質として用い反応を解析したものである。その結果、以下の事実が判明した。
(1)野生型オリゴマ-(35塩基)に対するKm=13.35M、Kcat=0.023/min。
(2)ル-プ中のリシン作用部位の構造はGAGA配列が必須である。
(3)ル-プの長さは17塩基(野生型)から、最小4塩基(GAGA)まで基質となり得た
(4)ステム長は、最小3塩基対まで基質活性を示し、塩基対の組み合わせには特異性がなかった。
以上より、この研究結果は、合成RNAオリゴマ-が今後のリシンA鎖の酵素反応機構の解析のモデル系として有用であることを示した。
2、細胞毒素、αーサルシンのクロ-ニングとその一次構造の決定
カビの産出する抗腫瘍因子、αーサルシンは、特殊なRNA分解活性を有する酵素で、リボソ-ム大RNAのリシン作用部位に隣接する、A4325/G4326間の燐酸ジエステルを一個水解することによって、リボソ-ムを不活性化する。本研究は、αーサルシンの分子機作を解明する目的で、cDNAクロ-ニング、塩基配列の決定を行った。その結果、27個のN末端にシグナルペプチドを含む177アミノ酸残基をもった前駆体として合成されることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Yaeta Endo: "RNAーProtein Interaction:an analysis with RNA oligoーnucleotides of the recognition by αーsarcin of a ribosomal domain critical for function" J.Biol.Chem.265. 2216-2222 (1989)
• [Publications] Tatsuzo Oka: "Complete nucleotide sequence of cDNA for the cytotoxin alpha sarcin" Nucleic Acids Research. 18. 1897-1897 (1990)
• [Publications] Yaeta Endo: "A new assay to measure RNA Nーglycosidase" Nucleic Acids Symposium Series. No.22. 21-22 (1990)
• [Publications] 遠藤 弥重太: "リシンA鎖によるリボソ-ム不活性化の分子機構" 化学と生物. 28. 437-444 (1990)
• [Publications] Yaeta Endo: "Ribosomal RNA identity element for ricin Aーchain recognition and catalysis" J.Mol.Biol.
• [Publications] Yaeta Endo: "A dynamic structure of the toxin domain of 28 S rRNA in eukaryotic ribosomes during protein synthesis" in preparation.
• [Publications] Ira G.Wool: "The Ribosome" American Society of Microbiology, 678 (1990)
• [Publications] Yoshifumi Takeda: "Advances in Research on Cholera and Related Diarrheas,7ed." KTK Scientific Publishers,Tokyo, 175 (1990)