1989 Fiscal Year Annual Research Report
Sporotrichum cellulophilumの生産するセルラ-ゼの多様性
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63550725
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
木下 晋一 大阪大学, 工学部, 助教授 (50029253)
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| Keywords | Sporotrichum cellulophilum / セルラ-ゼ / モノクロ-ナル抗体 / クロ-ニング(セルラ-ゼ) / 多様性(セルラ-ゼ) / 類縁性(セルラ-ゼ) / DNA配列(セルラ-ゼ遺伝子) / アミノ酸配列(セルラ-ゼ) |
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| Research Abstract |
S.cellulophilumからセルラ-ゼCII1、CII2、CIII1、CIII2、CIII3、CIVを精製し、CIII2、とCIVは糖鎖を除去した。これらからモノクロ-ナル抗体を調整したが、4つしか得られなかった。これらの抗体と精製酵素との反応性をELISA法で調べた結果、セルラ-ゼCIVはCIII2と最も近縁で、次にCIII1で、さらにCIII3とCII1で、CII2は殆ど関連性がなかった。
セルラ-ゼCIVのN末アミノ酸配列を決定しようとしたが、ブロックされていたので、リジルエンドペプチタ-ゼで切断後、HPLCで分離し、2つの断片のアミノ酸配列を22残基と31残基決定した。これらの配列に基づいて14〜29bの8種のDNAプロ-ブを合成した。常法によりS.cellulophilumからRNAを抽出し、cDNAライブラリ-を作成した。これをプロ-ブT(20b)でスクリ-ニングし、強くハイブリダイズするクロ-ンを得た。これからDNAを抽出し、プロ-ブC(23b)でハイブリダイズさせたが成功しなかった。
上の方法はcDNAの調整の効率が悪かったので糸状菌からDNAを抽出し、SauIIIA1で切断し、DNAライブラリ-を作成した。これをプロ-ブB(23b)で検索し、4.9bp断片を得た。これを種々な制限酵素で小分子化し、400bpのAlu1ーAlu1がプロ-ブと強く反応することを確認し、塩基配列を常法によって決定したが、アミノ酸配列と一致する部分は検出されなかった。次にプロ-ブD(29b)を用いて同様な方法で500bpのSmalーKpnl断片と1050bのEcoT221ーXbal断片を分離し、DNA配列を決定した結果、それぞれ7と6個のアミノ酸塩基の配列がセルラ-ゼのものと一致したが、それらの前後数百塩基からはセルラ-ゼのアミノ酸配列に相当する部分は見付けられなかった。
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