ファレノプシス葉肉細胞からのプロトプラストの単離、培養および植物体分化誘導

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63560029
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 田中 道男 香川大学, 農学部, 助教授 (10115975)
• Keywords: ファレノプシス / プロトプラストの単離 / プロトプラストの培養

Research Abstract

平成元年度においては、ファレノプシスの花茎培養由来のシュ-ト葉から単離したプロトプラストの培養条件を、以下の諸点から検討した。すなわち、(1)Gellan Gum培地中でのプロトプラストの培養、(2)フェノ-ル物質を吸着するポリビニ-ルピロリドン(PVP)添加培地での培養、(3)L-glutamineおよびL-ornitine-HCl添加効果の検討、(4)ココナッツウオ-タ-添加効果の検討、(5)基本培地(B5)に添加してきたadenineとビタミン類の濃度の検討、および(6)植物生長調節物質の濃度の検討、などである。なお、プロトプラストの単離は、以下の手順で行った。すなわち、(1)約1mm幅で細切した葉切片を前処理液(B5培地に400ppm PVP添加)に30分浸漬した後、(2)25℃、暗黒下で2時間30分の酵素液処理(B5培地に0.1%ペクトリア-ゼY-23,2%セルラ-ゼYC,13% sucroseおよび400ppm PVPを添加)を行い、プロトプラスト懸濁液を得た。(3)このプロトプラスト懸濁液をナイロンメッシュでろ過後、90xgで5分間遠心し、プロトプラストを浮上させて回収した。(4)これらのプロトプラストを洗浄液(B5培地に13%、sucroseおよび400ppm PVPを添加)に懸濁し、90xg10分間の遠心を2回行ってプロトプラストを精製した(プロトプラストの収量:約2x10^6個/gf.w.)。25℃、暗黒下において、上述の種々の培地条件でプロトプラストの培養を行った結果(密度:2.5x10^4個/ml)、基本培地に0.1mg/lNAA,5mg/lBA,5mg/l adenine,10mg/l L-ornitine-HCl,1g/l L-glutamine,0.5M Mannitol,2% sucrose,400ppm PVPを添加した培地(0.18% Gellan Gumでゲル化)において、培養1〜2週間後にプロトプラストの第一分裂が認められた。この分裂が認められた細胞はその後も分裂し、数細胞になったが、これまでのところコロニ-形成までにはいたっていない。この数細胞段階からコロニ-形成さらにはPLB形成までの諸条件については、現在検討中である。