1988 Fiscal Year Annual Research Report
組織培養汚染マイコプラズマ検出用合成オリゴヌクレオチドプローブの開発と応用
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63560290
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
原沢 亮 宮崎大学, 農学部, 助教授 (70159101)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水沢 博 国立衛生試験所, 細胞バンク, 室長
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| Keywords | マイコプラズマ / プローブ |
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| Research Abstract |
組織培養にはさまざまなマイコプラズマが重度に汚染するため、憂盧すべき事態となっている。たとえば(1)マイコプラズマに汚染された組織培養では培養細胞1個に10^2〜10^3個のマイコプラズマが付着するために、培養細胞のDNAを組換えDNA実験のDNA源とした場合には、その2.5〜25%がマイコプラズマ由来となるため、「実験指針」に抵触するような過ちを犯すことがあること、(2)マイコプラズマはヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有するため、ミエローマ細胞に汚染するとハイブリドーマ作出時のHAT培地での選択効率が著しく低するなど、重大な問題を生起する。本研究はこのように組織培養を汚染するマイコプラズマを菌種レベルで同定するために、各菌種のリボゾームRNAの塩基配列の中でその菌種に固有の領域を選択し、それに相補的な約25塩基からなるオリゴヌクレオチドを化学合成し、ビオチンもしくはハプテン等による非放射性標識を施し、プローブを作成することを初年度の目的とした。最初に化学合成したヌクレオチドはM.capricolumの5SRNAの中からループ領域に相当する25塩基に相補的な配列から成る。これをビオチン標識してプローブを作成し、ドット・ブロット法によるDNA-RNA交雑試験を行ったところ、ビオチンが細胞由来のタンパク質と反応するため非特異反応が認められ、実用性に乏しいことが判明した。そこで、アルカリホスファターゼによる酵素標識に切り代えて、DNA-RNA交雑試験を行ったところ、良好な成績が得られた。アルカリホスファクターゼ標識プローブはアイソトープ標識プローブに比べて100〜1000倍感度が低いが、安全性が高く、長期間保存できるなどの利点を有しており、しかも、最近開発されたPCR(polymerase chain reaction)法による標的DNAの増幅技術を応用することで、実用化可能と判断された。次年度はPCR法も含めて検討する予定である。
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