NADH-シトクロムb_5還元酵素の遺伝子構造と発現調節

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63570121
• Research Institution: Medical College of Oita
• Principal Investigator: 指吸 俊次 大分医科大学, 医学部, 助教授 (00019564)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 調 恒明 大分医科大学, 医学部, 助手 (50179058) ; 吉田 敏 大分医科大学, 医学部, 助教授 (50158440) ; 竹下 正純 大分医科大学, 医学部, 教授 (50019551)
• Keywords: シトクロムb_5還元酵素 / 遺伝子構造解析 / シトクロムb_5還元酵素欠損 / 点突然変異 / 変異酵素 / 大腸菌内発現

Research Abstract

本研究では、63年度中にNADH-シトクロムb_5還元酵素(b_5R)の染色体DNAの構造を明らかにし、またcDNAの大腸菌内発現系を確立した。平成元年度はこれに引き続いてb_5Rの「全身型」欠損患者の遺伝子解析を行い、その第5エクソン内にSer127のコドンTCTがProコドンCCTに変わった点突然変異を見出した。そこでこの塩基置換を部位特異的突然変異法を用いてcDNAに導入し、すでに開発した発現系を用いて大腸菌に患者で見出した変異酵素を発現させ、精製しその性質を調べた。この際、Ser→Proの変異では、Proが他のアミノ酸と異なりその骨格が歪んでいるためにb_5Rに構造変化をもたらしたのか、それともSerのOH基が重要な役割を果たしていて、そのOH基が失われたために活性が低下したのかを検討するためにSer→Ala変異酵素も作りその性質を調べた。両変異酵素では、吸収、蛍光、円偏光スペクトルが明らかに野生型酵素のそれらとは異なっていて構造変化が起きていることが分かった。また酵素活性を調べると、両変異酵素ではNADHに対するKmが5〜10倍に大きくなり、最大反応速度がSer→Pro酵素では野生型酵素の約30%に、Ser→Ala酵素では約60%に低下していた。さらに両変異酵素では熱安定性が野生型酵素よりかなり低下していた。
以上の結果から、Ser127はb_5RのNADH結合部位にあって他のアミノ酸と水素結合をして、構造の安定化に大きな役割を果していると考えられた。また「全身型」b_5R欠損患者のリンパ球では、抗体を用いた実験から正常人の場合と同程度の変異酵素が発現していることも明らかとなった。Ser127→Pro変異酵素について明らかとなったNADHに対するKmの増大と熱安定性の低下が、同患者の疾患発症の主原因であろうと考えている。現在他の「赤血球型」、「血液細胞型」b_5R欠損患者の遺伝子構造解析についても合わせて進めているところである。

Research Products

• [Publications] Murakami Kazunari: "The NH_2-Terminal Structures of Human and Rat Liver Microsomal NADH-Cytochrome b_5 Reductase" Journal of Biochemistry. 105. 312-317 (1989)
• [Publications] Shirabe Komei: "Expression of Human Erythrocyte NADH-Cytochrome b_5 Reductase as an α-Thrombin-Cleavable Fused Protein in Escherichia coli" Biochimica et Biophysica Acta. 1008. 189-192 (1989)
• [Publications] Tomatsu Shunji: "The Organization and the Complete Nucleotide Sequence of the Human NADH-Cytochrome b_5 Reductase Gene" Gene. 80. 353-361 (1989)
• [Publications] Yubisui Toshitsugu: "Structural Analysis of NADH-Cytochrome b_5 Reductase in Relation to Hereditary Methemoglobinemia" Progress in Clinical and Biological Research. 319. 107-121 (1989)
• [Publications] Shirabe Komei: "Four Cysteine Residues in Hyman NADH-Cytochrome b_5 Reductase Are Not Essential in the Catalytic Reaction" Protein Engeneering '89 Second International Conference. 212 (1989)
• [Publications] Kobayashi Yasushi: "Serine-Proline Replacement at Residue 127 of NADH-Cytochrome b_5 Reductase Causes Hereditary Methemoglobinemia,Generalized Type" Blood. (1990)
• [Publications] Yubisui Toshitsugu: "Structural Role of Serine 127 in NADH-Binding Site in Human NADH-Cytochrome b_5 Reductase"