1988 Fiscal Year Annual Research Report
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63570213
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
牧野 芳大 琉球大学, 医学部, 助教授 (60039930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安齊 俊一 琉球大学, 医学部, 助手 (20193097)
只野 昌之 琉球大学, 医学部, 助手 (80179712)
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| Keywords | デング4型ウイルス / コア遺伝子 / バキュロウイルス / 遺伝子発現 / 核内抗原 |
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| Research Abstract |
1。組換えバキュロウイルスの作成:
デング4型ウイルス(D4V)のコア蛋白遺伝子を含んだCDNAを制限酵素(BalII NcoI)で切り取った。この両端にBamHIリンカーを付けた後、バキュロウイルス(AcNPV)のトランスファーベクター(pAc373)のBamHI部位に挿入した。このトランスファーベクターのDNAとAcNPVのDNAとをsf-9細胞に共感染させ、ウイルスの組換え体を作成した。この感染細胞培養液をsf-9に感染させ、プラークを作らせた。このプラークの中からポリヘドリン陰性のプラークを拾い出し、更に3回のクローニングを行ない、組換えバキュロウイルス(373-core)を得た。
2。組換えバキュロウイルス感染細胞内の発現蛋白の性状:
373-core感染SF-9細胞を固定し、D4Vのコアに対するモノクローン抗体(MA6)を用いたPAP染色を行なたところ、感染細胞の核および細胞質にMAbと反応する蛋白が多量産生されていた。この細胞を更に核と細胞質に分画し、MAbを用いたウエスタンブロット(wB)を行なったところ、核分画に分子量約25Kの発現蛋白が多量蓄積しMAbと特異的に反応していることが認められた。D4Vのコア蛋白の分子量は約15.5Kであることから、この発現蛋白はポリヘドリンの一部と融合した融合蛋白として産生されているものと考えられた。
3。発現蛋白の精製および抗体の作成:
373-core感染sf-9細胞をSDS-電機泳動し、染色後25Kの発現蛋白のバンドを切り取り溶出した。この蛋白を精製・濃縮し、アジュバンドと共にマウス腹腔に接種した。同様の精製蛋白を5回免疫した後腹水癌細胞を接種し免疫腹水を得た。この免疫腹水を用い、デングウイルス1〜4型および日本脳炎ウイルス感染細胞についてWBを行ったところ、D4Vのコア蛋白とのみ反応し、型特異性が認められた。
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