新しい5'ーヌクレオチドホスホジエステラ-ゼの精製と生理的意義及び癌との関連

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63571034
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 鈴木 日出夫 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (50013321)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 敏男 帝京大学, 理工学部, 教授 (10013327)
• Keywords: 癌細胞特異的 / 5'ーヌクレオチドホスホジエステラ-ゼ / エ-ルリッヒ腹水癌細胞 / 酵素精製 / モノクロ-ナル抗体

Research Abstract

我々が多くの癌細胞に新しく見いだした5'ーNPDaseが、はたして本当に癌細胞に特有なものといえるのか、もしそうだとしてそのモノクロ-ナル抗体を得ることできれば、それを癌の診断に役立てることができるかという問題が残された興味ある問題である。そこで、エ-ルリッヒ腹水癌細胞よりこの酵素を精製し、それを抗原としてモノクロ-ナル抗体の作成を試みた。方法:多量のエ-ルリッヒ腹水癌細胞を集め、各種のカラムクロマトグラフィ-によりこの酵素を精製した。この酵素蛋白を抗原として次のようにして雌BALB/cマウス(8週齢)を2週間おきに免疫した。(1)20μg(0.1ml)を0.1mlのFreund's completeadjuvantと一緒に皮下注射;(2)10μgを皮下注射;(3)10μgを静脈注射。最後の注射から4日後に脾細胞を摘出し、その細胞1.8x10^8とマウスミエロ-マP3ーX63ーAg8ー6.5.3細胞0.6x10^8とを,43%のポリエチレングリコ-ル4000と13%のジメチルスルフォキサイドを含む血清なしのRPMIー1640培地中で細胞融合させた。その後、細胞を20%牛胎児血清を含むRPMIー1640培地に移し、18時間後に細胞をさらにHAT培地(100μM hypoxanthine,0.4μM aminopterine,16μMthymidine)に移して細胞浮遊液を調製した。この120μlずつを、雌BALB/cマウスより摘出した胸腺細胞をあらかじめ加えた(10^6コ/well)96穴プレ-ト20枚にまいた。約2週間後に、生えてきたハイブリド-マを24穴プレ-トに移し増殖培地で培養を続けた。5'ーNPDase蛋白に対するモノクロ-ナル抗体の有無は、培養液を抗マウスIgM抗体をコ-トしたStaphylococcus aureus菌体とインキュベ-トして免疫沈降物を作り、これがエ-ルリッヒ腹水癌細胞からの5'ーNPDase活性を阻害するか否かで調べた。結果:現在までのところ、エ-ルリッヒ腹水癌細胞からの5'ーNPDaseに選択的に反応するモノクロ-ナル抗体は得られていない。多量のエ-ルリッヒ腹水癌細胞を集めて、この酵素を精製しなければならず、それを抗原としてマウスを感作し、さらにそのマウスより脾細胞をとってマウスミエロ-マ細胞と融合し、多数のハイブリド-マの中からこの酵素に対する抗体を作っているものを捜し出すという時間のかかる根気の要る作業である。我々の研究室では、すでにこのような方法でいくつかのほかのものに対するモノクロ-ナル抗体を得ることに成功しているので、いずれ目的のモノクロ-ナル抗体が得られるものと考えている。