DNA中のZ型-B型接合部の化学修飾による構造研究

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63571042
• Research Institution: OKAYAMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 根岸 和雄 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70116490)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅田 真郷 東京大学, 薬学部, 助手 (10185069)
• Keywords: 亜硫酸 / メトキシアミン / 左まきDNA / B型-Z型接合部 / モノクロ-ナル抗体 / 高塩濃度 / 化学修飾 / DNAポリメラ-ゼ

Research Abstract

今年度は、亜硫酸-メトキシアミン混合試薬による核酸の構造研究について、実験を行った。この混合試薬は核酸中の一本鎖部位のシトシンに反応し、N^4-methoxy-5,6-dihydrocytosine 6-sulfonateとする。この反応を利用して、DNA中のB-Z接合部の検出に利用できるかどうかを検討した。GCの繰り返し配列を持つ環状DNAに負の超ラセンを与え、GC繰り返し配列をZ型とした。このDNAを亜硫酸-メトキシアミン混液で処理し、S1ヌクレア-ゼを用いて修飾部位の検出を試みた。その結果、修飾を受けたのは、B型DNAとZ型DNAの境界部位であることがわかった。さらに、適当なプライマ-をアニ-ルし、DNAポリメラ-ゼによるDNA鎖伸長反応の停止位置から修飾部位を塩基レベルで同定した。これはこの部位がDNAの二本鎖構造がゆるんだ形をとっているという従来得られている知見と一致する。さらに高塩濃度下で誘導されるB-Z接合部も同様に修飾されることを見いだした。ここでB-Z接合部が二本鎖DNAの平滑末端の様な構造であっても同様に修飾を受けるのではないかと考えた。そこでそのモデルとして、平滑末端を持つ二本鎖合成オリゴヌクレオチドを修飾しその分析を行った。その際、N^4-methoxy-5,6-dihydro(deoxy)cytidine 6-sulfonateに対するモノクロ-ナル抗体の利用を検討した。この付加体は、二種のジアステレオマ-の存在が予想され、我々もオリゴヌクレオチドレベルでこのことを確認している。この付加体に対する市販の抗体をしらべたところ、一方の付加体に選択的に結合することがわかった。これを利用して、シトシンが3'末端に位置するときと5'末端に位置する時とでは異なった異性体ができることがわかった。この結果は二本鎖平滑末端のシトシンがこの試薬で修飾されることを示している。これは、B-Z接合部構造がいわゆる一鎖DNAではなく、水素結合が完全には失われていない可能性を示唆するもと思われる。

Research Products

• [Publications] K.Negishi: "Mutagenic nucleoside analog NA^4-aminocytidine:metabolism,incorporation into DNA,and mutagenesis in Escherichia coli" J.Bacteriol. 170. 5257-5262 (1988)
• [Publications] T.Bessho: "Spectrum of N^4-aminocytidine mutagenesis" J.Mol.Biol.205. 659-664 (1989)
• [Publications] 根岸和雄: "N^4-アミノシチジンによる突然変異の機構" 薬学雑誌. (1900)