1989 Fiscal Year Annual Research Report
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63571046
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
井本 泰治 九州大学, 薬学部, 教授 (90038282)
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| Keywords | ニワトリリゾチ-ム / 蛋白質工学 / 変異リゾチ-ム / アミノ酸配列 / 蛋白質機能 / フォルディング |
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| Research Abstract |
蛋白質工学によりニワトリリゾチ-ムの機能向上を目的に以下の研究を行った。1.大腸菌によるニワトリリゾチ-ムの生産系を用いて、N末端にMetが付加し、さらに種々のアミノ酸残基の置換を施した変異リゾチ-ムを生産し、これらを活性構造に巻き戻した。2.この系で生産したリゾチ-ムのN末端は天然型と異なるため、これを天然型にするために、N末端にMetーTyrが付加したリゾチ-ムから出発して試験管内でこれを切り落とす方法を確立した。3.昨年度に改良した酵母の発現分泌系を用いて、種々の変異リゾチ-ムを生産した。4.種々の変異リゾチ-ムの性質の検討から以下の事がわかった。(1)触媒基であるGlu35とAsp52の置換体は、いずれもリゾチ-ム活性がほぼ消失した。(2)Asp52の置換体は、基質結合能が低下した。(3)35位に導入した解離性残基のpKはすべて異常となり、この部位に電荷をおくことは不都合であることがわかった。(4)Trp108をGlnで置換すると、活性は消失し、安定性も極めて低下した。(5)βーシ-ト上のAsn46をAspで置換すると、活性が約1/4に低下し、活性の極大pHも、約0.5酸性側にシフトした。(6)37位及び101位をGlyで置換すると、溶菌活性が上昇した。(7)14位と15位を共に欠失させた変異リゾチ-ムの熱安定性は低下したが、活性は向上した。(8)αーラクトアルブミン様のカルシウム結合部位を構築したリゾチ-ムの還元状態からの巻戻しはカルシウム濃度で制御できた。5.昨年度に引続き安定性及び活性の向上したリゾチ-ムを生産するためには、どの様な変異を導入すればよいかを天然の変異に学ぶために、猪、豚、スナメリ(小型鯨)、犬及び、シロカン(鳥類)のリゾチ-ムを単離し、それらの一次構造と活性及び安定性を調べた。機能の向上に寄与していると考えられるアミノ酸置換を検索中である。
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Research Products
(8 results)
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[Publications] K.Fujita: "Enzymatic synthesis of specifically modified linear oligosaccharide from γ-cyclodextrin derivatives.Study on importance of active sites of Taka amylase A." Bull.Chem.Soc.Japan. 62. 3150-3154 (1989)
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[Publications] K.Fujita: "Regiospecifically bifunctional cyclodextrin having two amino groups on secondary hydroxyl side." J.Org.Chem.53. 1943-1947 (1989)
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[Publications] Y.Ito: "Purification,amino acid sequence and some properties of rabbit kidney lysozyme." J.Biochem.107. 236-241 (1990)
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[Publications] H.Yamada: "Solubilization of reduced and denatured proteins by S-alkylation with charged reagents." J.Biol.Chem.
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[Publications] H.Yamada: "Reaction of hen egg-white lysozyme with tetranitromethane.Abnormal bond cleavage at glycine 104 and sequential nitration of three tyrosine residues." J.Biol.Chem.
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[Publications] T.Ueda: "Effects of artificial intramolecular cross-links on the renaturation rate of reduced lysozyme." Biochemistry.
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[Publications] T.Imoto: "Protein Function:A Practical Approach(T.E.Creighton,ed.)Chapter 10.Chemical Modification" IRL Press, 31 (1989)
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[Publications] 井本泰治: "タンパク質工学への招待" 南江堂, 123 (1989)
