再構成膜系における筋小胞体カルシウムポンプのエナジェティックス

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63617509
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 桐野 豊 九州大学, 薬学部, 教授 (10012668)
• Keywords: 筋小胞体 / 再構成膜 / 平面膜 / 巨大化ベシクル / カルシウムポンプ

Research Abstract

1.筋小胞体カルシウムポンプを平面膜または巨大ベシクルに組み込んだ再構成系を構築し、ポンプ活性を電気生理学的に測定して、再構成系の有用性を示すことを目的とした。2.ウサギ骨格筋小胞体の軽い分画を界面活性剤で可溶化し、液体クロマトグラフィーによりカルシウムポンプ蛋白質を精製した。可溶化した大豆リン脂質との混合物から、界面活性剤を除去して、再構成プロテオリポソームを調整した。これを予め水溶液中で形成した脂質平面膜に融合させて、カルシウムポンプを平面膜に再構成した。膜の両側の溶液組成をポンプ活性が最大になるように調整し、膜の片側(cis側)の溶液にATPを添加して、短絡電流を測定した。最終濃度4.3mMのATPを加えると、cis側からtrams側へ向かう、15-30 5Aの電流が観測された。灌流してATPを除去すると、この電流は消失した。このサイクルは何回も繰り返すことができた。ATPの濃度を段階的に増大させて行くと、電流は段階的に増大しやがて飽和した。電流値はATP濃度に対してミカエリス・メンテン型の存在性を示し、Km値は0.56mMとなった。この値は、筋小胞体膜ATPaseのATP加水分解反応のKm値として報告されている値(2-3μM及び500μM)の大きい方の値と近い値である。3.巨大ベシクル系において、ポンプ活性を測定する手法として、微小カルシウム電極を用いたベシクル内カルシウム濃度の測定は意義深いと考えられる。この為、筋小胞体ベシクルを融合させて、外在脂質なしに、巨大化ベシクルを調整せんとした。プロテアーゼ処理、ポリエチレングリコール処理、凍結-融解処理、電場融合法の適用、及び、これらの組み合わせ処理を行ったところ、直径1.0μm程度の巨大化ベシクルを得ることができた。この巨大化筋小胞体ベシクルは、カルシウム輸送活性を保持しており、さらに、これまで再構成系では不可能とされていた微小電極の刺入を行うことができた。

Research Products

• [Publications] Ken-ichiro,Higashi: Journal of Biochemistry. 101. 433-440 (1987)
• [Publications] Kazunori,Anzai: Biochemica et Biophysica Acta. 937. 73-80 (1988)
• [Publications] Chie,Fujiwara: Journal of Biochemstry. 104. 344-348 (1988)
• [Publications] Yoshiro,Saito: Biochemcal and Biophysical Research Communications. 154. 85-90 (1988)
• [Publications] Naohide,Hirashima: Biochemica et Biophysica Acta. 946. 209-214 (1988)
• [Publications] 桐野豊: 蛋白質核酸酵素. 33. 1877-1887 (1988)
• [Publications] 小畠陽之助: "生体現象の物理化学" 講談社サイエンティフィク, 217 (1987)
• [Publications] 松橋道生 編: "新基礎生化学実験法第5巻「高次構造・状態分析」" 丸善,