動物細胞および動物個体への染色体を介する遺伝子導入法の開発

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63860012
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 水野 重樹 東北大学, 農学部, 教授 (90112903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 結城 淳 雪印乳業(株), 生物科学研究所, 主査 ; 西森 克彦 東北大学, 農学部, 助教授 (10164609)
• Keywords: 染色体単離法 / MSB-1細胞(ニワトリの) / L細胞(マウスの) / TaqI 80bp反復単位(ニワトリの) / 同調培養 / pSV_2Neo / pRSVNeo / メチルセルロ-ス培地

Research Abstract

1.ニワトリの培養細胞からの染色体の単離法:雌ニワトリの脾臓由来のMSB-1細胞を2mMチミジンで2回(15時間および10時間)処理して同調培養化したのち、コルセミドを加えて分裂中期の細胞が約60%に達した細胞集団を得た。これらの細胞を0.2mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、80mMKCl 20mMNaClを含むバッファ-にけん濁後、0.1%ジギトニンを加え、ボルテックスミキサ-1分間処理で細胞を破壊し、分画遠心法(1000rpm10分の上清から3000rpm 10minで沈澱)により染色体を約25%の収率で回収した。染色体けい濁液をサイトスピン1300rpm5分間の条件でスライドグラス上に広げたのち、固定、ギムザ染色を行って調べた結果、形態の良い染色体が単離されたことが分かった。
2.ニワトリの常染色体に一般的なDNAプロ-ブのクロ-ニング:ニワトリのゲノムDNAを制限酵素TaqIで分解すると約80bpを最小単位とする反復配列が認められた。この80bp単位をクロ-ン化して^<32>p-標識プロ-ブとして、雌、雄のニワトリおよびマウスのゲノムDNA(EcoRI、HinfIまたはTaqIで分解したもの)に対してサザンハイブリダイゼ-ションを行ったところ、ニワトリのDNAに対してのみ雌雄にかかわらずハイブリッド形成が認められた。このプロ-ブはマウスの細胞核内に導入されたニワトリの染色体を検出するために有用であると思われる。
3.染色体導入の際に同時に導入するDNAマ-カ-の検討:細胞への遺伝子導入の選択マ-カ-としてネオマイシン(G418)耐性遺伝子を同時に導入する方法が有効と考えられる。そこで、マウスのL細胞、ニワトリのMSB-1細胞へのNeo遺伝子の導入、発現法を検討した。その結果L細胞に対してはpSV_2Neo、MBS-1細胞に対してはpRSVNeoをエレクトロポレ-ション法で導入することが有効であった。浮遊細胞であるMSB-1には1.5%メチルセルロ-ス、0.4mg/ml G418選択培地が利用できた。

Research Products

• [Publications] Hisato Saitoh: "Presence of female-specific bent-repetitive DNA sequences in the genomes of turkey and pheasant and their interactions with W-protein of chicken" Chromosoma. 98. 250-258 (1989)
• [Publications] Takashi Ninomiya: "Instability of inverted repeats in a transgenic mouse line during germline transmission" Agric.Biol.Chem.53. 369-375 (1989)