2015 Fiscal Year Annual Research Report
一本鎖核酸をトリガーとする生体分子モータースイッチングシステムの開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Development of Molecular Robots equipped with sensors and intelligence |
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| Project/Area Number |
15H00801
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
庄田 耕一郎 東京大学, 総合文化研究科, 助教 (00401216)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 脂質－DNAコンジュゲート / 長鎖アルキル置換デオキシウリジン / 生体分子モーター / ATP / 巨大一枚膜リポソーム / Sonogashira反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究目的である生体分子モーターをスイッチオンする分子システムの開発のために、初年度は、脂質－DNAコンジュゲート分子の合成を行った。脂質－DNAコンジュゲート分子は、脂質部分がリポソーム膜に埋まり、DNA部分はリポソーム表面に突き出た形で存在すると期待される。その状態でDNA部分に相補的なオリゴDNA（またはRNA）がハイブリダイゼーションすると、脂質部分がリポソーム膜から引き抜かれるので、リポソームが不安定化され崩壊や変形を起こすと期待される。その結果、リポソーム内に封入してあったATPなどのエネルギー源が外に漏れだし、生体分子モーターが動き出す。
脂質－DNAコンジュゲート分子は、デオキシウリジンの塩基部5位を長鎖アルキル基で置換したホスホロアミダイトユニットを合成することで、得る。種々検討を重ねた結果、トータル４ステップ、平均合成収率79％で、重要な合成中間体である長鎖アルキル置換デオキシウリジンアミダイトユニットを得ることに成功した。二年目は、このアミダイトユニットを用いて、長鎖アルキル基を複数（４本程度）持つ、オリゴDNAを合成する。
また、本研究で用いるリポソームは、容量が大きくて薄い巨大一枚膜リポソームが最適である。申請者は、生体分子モーターが動作する生理的イオン条件下でも、安定的に巨大一枚膜リポソームを調製できる手法の開発に成功し、2015年にBiochem. Biophys. Rep.誌に論文が掲載された。二年目の実験では、この方法を用いて、実験に必要な巨大一枚膜リポソームを調製する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時は、脂質－DNAコンジュゲート分子ではなく、ペプチド核酸(PNA）－DNAコンジュゲート分子を合成する予定であった。PNA・DNAともに、ファスマック社で受託合成が可能であり、かつ、ファスマック社はこれまで申請者と何度も持ち込みアミダイトによる特殊修飾オリゴDNAの合成実績があった。しかし、DNAは国内で合成できるものの、PNAは海外で合成されるので、PNA－DNAコンジュゲートに、持ち込みユニットを組み込んだ特殊合成を行うことは、技術的に難しいことが判明した。そこで、方針を変え、全てDNAおよびDNA誘導体からなる脂質－DNAコンジュゲートにデザインを変更した。この変更により、合成が必要な分子を1/2に減らすことが出来た。
重要な合成中間体である長鎖アルキル置換デオキシウリジンアミダイトユニットは、長鎖アルキル基をSonogashira反応でデオキシウリジン塩基部5位に導入したが、当初は非常に合成効率が低かった。種々検討した結果、溶媒であるDMFに溶解した酸素を減圧下抜気し乾燥アルゴンで置換することで、顕著に収率が向上することを見出した。
また、申請時には論文として報告出来てなかった、巨大一枚膜リポソーム調製法を2015年にBiochem. Biophys. Rep.誌に掲載することが出来た。ピアレビューによって本手法がオーソライズされたので、プロジェクト内の多くの研究者にも安心して使ってもらうことができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
二年目は、初年度に合成した長鎖アルキル化アミダイトユニットを用いて、脂質－DNAコンジュゲート分子の合成を行う。アミダイトユニットをファスマック社に送付し、受託合成する。本ユニットのように、デオキシウリジンの塩基部5位を置換したアミダイトユニットは種々開発されており、そのほとんどが良好なカップリング収率を与えることが知られている。であるので、申請者が開発したアミダイトユニットも、良好なカップリング収率を与えると期待される。もし仮に、カップリング収率が低い場合は、キャッピングをスキップしてカップリングを2回行うよう、合成プロトコルを変更する予定である。
脂質－DNAコンジュゲート分子が合成できたら、申請者が開発した手法を用いて巨大一枚膜リポソームを調製し、そのリポソーム膜上に脂質－DNAコンジュゲート分子を組み込む検討を行う。リポソーム調製時、または、調製後に、脂質－DNAコンジュゲート分子を混ぜると、コンジュゲート分子の脂質部分が自発的にリポソーム膜に埋まると期待できる。その状態で、相補的なオリゴDNA（またはRNA）とハイブリダイゼーションさせれば、脂質部分がリポソーム膜から引き抜かれて二重鎖のメジャーグルーブに格納される。その結果、リポソームは不安定化し、内部に封入したATPなどのエネルギー源が漏洩し、生体分子モーターが駆動することが期待できる。
相補的DNAのハイブリダイセーションをトリガーとして、リポソームから小分子が漏洩する条件を探し、光学顕微鏡やフローサイトメーターを用いてその現象を可視化する。もしこの現象が確認できたら、プロジェクト内の生体分子モーターの専門家と共同研究し、オリゴDNA添加で生体分子モーターをスイッチングする研究を行う予定である。
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