2015 Fiscal Year Annual Research Report
歪みに感応するヘム分解機構とその精密制御
Publicly Offered Research
| Project Area | Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules |
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| Project/Area Number |
15H00912
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
松井 敏高 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (90323120)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 酵素反応 / 反応機構 / 病原性細菌 / 酸素添加 / 酸素活性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結核菌のIsdG型ヘム分解酵素（MhuD）に結合したヘムは異常に歪んでおり、特殊な生成物（マイコビリン）を与える新規反応機構に注目されている。これまでの研究により、従来型ヘム分解酵素と共通する中間体（水酸化ヘム）が、MhuDでは異常な反応性を示すことを明らかにしていた。本研究では、MhuDにおける水酸化ヘムの特殊な開環機構の解明を試みた。
当初、MhuDによる水酸化ヘム開環には分子状酸素（O2）だけでなく、過酸化水素や還元剤が必要と予想されたが、詳細な解析の結果、いずれも不要であることが分かった。さらに、滴定実験によってO2の必要量が水酸化ヘムに対して１当量であることも示され、２原子酸素添加反応による開環機構が示唆された。そこで、同位体ラベルによって生成物への酸素取り込み様式を検討したところ、予想通り、１分子のO2から２つの酸素原子が添加されることが示された。MhuDの初反応（水酸化ヘムの生成）は１原子酸素添加反応であり、MhuDは２種類の酸素添加を同一活性部位で行う初めての酵素となる。この特殊な異種機能の融合により、結核菌は自身の生存に有利な特殊な代謝反応を手に入れたと考えられる。
さらに開環反応の解析を進め、詳細なメカニズムを解明した。水酸化ヘムと酸素の反応は中心鉄へのCO結合では阻害されなかったため、O2は中心鉄ではなく、ポルフィリン環を直接攻撃すると考えられる。生成物構造も考慮するとジオキセタン中間体を経由する開環機構が提案された。O2との反応で生成する中間体は鉄-ビリベルジン錯体に似た吸収スペクトルを示し、非常に異方的なEPRシグナルを与えた。質量分析によってホルミル基の存在も示唆されたことから、既に開環した鉄-マイコビリン錯体と考えられる。以上の成果により、MhuDによるマイコビリン生成機構がほぼ解明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、非常に複雑な反応と予想されていたMhuDの反応を、ほぼ全て解明することに成功した。特に、従来は想定もされていなかった２原子酸素添加による開環反応を発見したことは高く評価される。その証明にあたり、通常行われている生成物の質量分析では、ホルミル基と水分子の酸素交換のため、はっきりした結果が得られなかった。しかし、反応中間体をタンパク質複合体のまま測定することで、酸素交換の影響を排除した機構決定が可能となった。今後、同様の手法は酵素メカニズム研究の重要なテクニックの一つになるとも考えられる。分光測定などによる水酸化ヘムの電子状態の解明については少し遅れがあるものの、既に測定準備は進めており、次年度には十分な成果が得られると考えている。以上のことから、現在までの達成度は「概ね順調に進展している」ものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、水酸化ヘム-MhuDの結晶構造解析により、特殊な反応性を生み出す構造要因を探る。MhuDには複数のヘムが結合するため、嫌気条件での取り扱いが必要な水酸化ヘム複合体の結晶化は困難であった。しかし、現在までにヘムを１分子のみ結合できるMhuD変異体を見いだし、基本的な反応特性に変化がないことを確認している。このMhuD変異体について、まずはヘム複合体の結晶化・構造解析を行い、同様の条件での水酸化ヘム複合体の構造決定を試みる。
第二に、高pH条件におけるMhuDの反応を検討する。MhuD反応ではマイコビリン以外に、ピロールユニットが１つ脱離したと思われる開環生成物も得られている。ピロールの脱離は後述の黄色ブドウ球菌IsdGにおけるHCHO脱離にも通じる反応で有り、この理解がIsdG反応の解明にも重要である。アルカリ性の反応条件では脱離生成物が優勢となるため、高pH条件での生成物の構造決定および反応機構解明を試みる。特に、ピロール脱離が開環後に起こるのか、開環と同時に起こるのかが注目点となる。
第三に、上記の研究成果も活用して、黄色ブドウ球菌IsdGの反応解明に取り組む。HCHO遊離のタイミングを中心にメカニズムの解明に取り組み、MhuDとの生成物の違いが生まれる要因を明らかにする。現時点では、開環生成物からの鉄イオン遊離と還元によるO2活性化の競合により、生成物が変化すると考えている。反応性の差異の構造的要因を明らかにするとともに、その生理的意義に迫ることを最終目的とする。
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