2015 Fiscal Year Annual Research Report
時間分割解析を用いた二核銅酵素チロシナーゼの反応機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules |
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| Project/Area Number |
15H00947
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
的場 康幸 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 准教授 (90363051)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | チロシナーゼ / 銅 / ラマンスペクトル / X線結晶構造解析 / 反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チロシナーゼは、活性中心に二核銅を有する酸化酵素であり、チロシンをドーパキノンへと変換する反応を触媒する。申請者は、チロシナーゼに特異的な銅輸送タンパク質（キャディー）との複合体として、チロシナーゼの三次元構造を決定した。さらに、活性中心にあるキャディーのTyr98残基が、チロシナーゼの触媒作用によりドーパキノンへと変換されうることを発見した。共鳴ラマンスペクトルを測定した結果、チロシナーゼをオキシ型に変換すると、初期段階でμ-η2:η2-ペルオキソ二核銅(II)が形成し、最終的にドーパセミキノン・Cu(II)複合体が生じることが明らかになった。さらに、Ｘ線結晶構造解析を用いた検討からは、チロシナーゼ・キャディー複合体の結晶中でオキシ型チロシナーゼを形成させると、Tyr98残基のオルト位に濃い電子密度が観測され、結晶中でもチロシナーゼ反応が進行していることが強く示唆された。
これまでの検討から、キャディーのTyr98残基に対するチロシナーゼの大まかな反応機構を提唱することができた。次の課題として、Tyr98残基に対するチロシナーゼの反応性を弱めることで、短寿命の反応中間体を捉えることを試みた。具体的には、キャディーのTyr98残基をフッ化チロシンに置換することに取り組んだ。無細胞タンパク質合成システムを用いて、フッ化チロシンを導入したチロシナーゼ・キャディー複合体を取得することを試みたが、得られた複合体の溶解度が低いことが判明した。そこで、フッ化チロシンを導入したキャディーのみを無細胞タンパク質合成システムで合成し、チロシナーゼ単体は野生型複合体から調製し、その後両者を混合することで、目的とする複合体を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
フッ化チロシンの導入によりチロシナーゼ・キャディー複合体の溶解度が低下したため、別の調製方法を検討しなければいけなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに開発した方法で目的タンパク質を調製し、共鳴ラマンスペクトル測定とX線結晶構造解析を実施する。また、チロシナーゼと相同性を持つものの、チロシン酸化活性が低い酵素についても、キャディーと複合体を形成させることを試みる。
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