細胞壁再構成をともなう離生細胞間隙形成の分子機構

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Plant cell wall as information-processing system
• Project/Area Number: 15H01233
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 石崎 公庸 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00452293)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 植物 / 細胞壁 / 微小管 / 光合成 / コケ植物 / 進化

Outline of Annual Research Achievements

NOP1-Citrineをnop1変異体に導入し気室形成が回復した相補株と、NOP1のE3リガーゼ活性に必要なU-boxドメインを欠失した⊿UboxNOP1-Citrineを導入したnop1変異体と用いてNOP1と相互作用するタンパク質およびNOP1と相互作用しプロテアソームによる分解を受けるタンパク質候補を免疫沈降実験とLC-MSMSによるプロテオーム技術により解析した。候補となるタンパク質候補は数百にも及んだが、細胞内局在や機能ドメイン予測などの情報を併せて解析対象を28個にまで絞り込んだ。絞り込んだNOP1相互作用因子候補には、微小管や細胞骨格関連因子、セルロース合成酵素関連因子、膜交通関連因子、受容体キナーゼなどが含まれている。これらのNOP1相互作用因子候補をコードする遺伝子について、CRISPR/Cas9によるノックアウト株の作出を進めており、現在のところ２つの遺伝子について、気室形成に関連する表現形が見えている。そのうち、キネシン様カルモジュリン結合タンパク質ZWICHELの相同遺伝子CUFF.4329を破壊すると表面から気室孔が観察されず正常な気室形成が確認できない。CUFF.4329の破壊株は、気室の他にも仮根や葉状体の形態に異常が認められる（NOP1は野生株と変わらない）。また表層微小管とCESA複合体を連結するCELLULOSE SYNTHASE-INTERACTIVE1遺伝子の相同遺伝子CUFF.11924を破壊すると気室形成頻度が著しく減少し、形成された気室も異常な形態を示した。今後、これらの候補遺伝子の機能解析を進めるとともに、NOP1との相互作用について複数の手法を用いて確認し、ゼニゴケにおける離生細胞間隙形成にともなう気室形成機構を明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、基部陸上植物ゼニゴケの気室形成をモデルに、植物の離生細胞間隙形成の制御メカニズムを解明することを目的としている。ゼニゴケの離生細胞間隙形成を制御するE3リガーゼNOP1の相互作用因子候補を絞込み、更にその中から気室形成に関わる制御因子の同定にトライしてきた。プロテオミクス解析では、解析対象となる相互作用因子候補が多すぎること、実験毎のバラつきが大きいことが問題となった。しかしながら、CRISPR/Cas9による新しい変異体作出法を導入することにより、当初の想定よりもハイスループットな遺伝子機能解析系が確立された。この技術の導入により、離生細胞間隙形成の関連因子が複数見つかりつつある。

Strategy for Future Research Activity

現在進めている、相互作用因子候補の機能解析については、CRISPR/Cas9系によるゲノム編集系による機能欠損変異体の作出と表現形解析を行っていく。機能欠損変異体について、気室形成に異常が確認され、気室形成に関連する機能が考えられる遺伝子については、発現組織やNOP1との相互作用について詳細な検証を行う。以上の情報を統合し、ゼニゴケにおける離生細胞間隙形成にともなう気室形成制御機構を明らかにする。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Monash University(Australia)
  • Country Name: Australia
  • Counterpart Institution: Monash University
• [Int'l Joint Research] Joint Genome Institute, DOE(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Joint Genome Institute, DOE
• [Int'l Joint Research] Gregor Mendel Institute(Austria)
  • Country Name: Austria
  • Counterpart Institution: Gregor Mendel Institute
• [Int'l Joint Research] University of Oxford/University of Cambridge(United Kingdom)
  • Country Name: United Kingdom
  • Counterpart Institution: University of Oxford/University of Cambridge
• [Journal Article] Molecular Genetic Tools and Techniques for Marchantia polymorpha Research (2016)
  • Author(s): Ishizaki, K., Nishihama, R., Yamato, K.T. and Kohchi, T.
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: 57 Pages: 262-270
  • DOI: 10.1093/pcp/pcv097
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SNARE molecules in Marchantia polymorpha.: unique and conserved feature of the membrane fusion machinery. (2016)
  • Author(s): Kanazawa, T., Era, A., Minamino, N., Shikano, Y., Fujimoto, M., Uemura, T., Nishihama, R., Yamato, K.T., Ishizaki, K., Nishiyama, T., Kohchi, T., Nakano, A. and Ueda, A.
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: 57 Pages: 307-324
  • DOI: 10.1093/pcp/pcv076
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] RSL class I genes controlled the development of epidermal structures in the common ancestor of land plants. (2016)
  • Author(s): Proust, H., Honkanen, S., Jones, V.A., Morieri, G., Prescott, H., Kelly, S., Ishizaki, K., Kohchi, T. and Dolan, L.
  • Journal Title: Current Biology Volume: 26 Pages: 93-99
  • DOI: 10.1016/j.cub.2015.11.042
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Auxin produced by the indole-3-pyruvic acid pathway regulates development and gemmae dormancy in the liverwort Marchantia polymorpha. (2016)
  • Author(s): Eklund, D.M., Ishizaki, K., Flores-Sandoval, E., Kikuchi, S., Takebayashi, Y., Tsukamoto, S., Hirakawa, Y., Nonomura, M., Kato, H., Kouno, M., Bhalerao, R.P., Lagercrantz, U., Kasahara, H., Kohchi, T. and Bowman, J.L.
  • Journal Title: The Plant Cell Volume: 27 Pages: 1650-69
  • DOI: 10.1105/tpc.15.00065
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of Gateway binary vector series with four different selection markers for the liverwort Marchantia polymorpha. (2015)
  • Author(s): Ishizaki, K., Nishihama, R., Ueda, M., Inoue, K., Ishida, S., Nishimura, Y., Shikanai, T., Kohchi, T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0138876
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0138876
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of schizogenous intercellular spaces in plants. (2015)
  • Author(s): Ishizaki, K.
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 6 Pages: 497
  • DOI: 10.3389/fpls.2015.00497
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Auxin-mediated transcriptional system with a minimal set of components is critical for morphogenesis through the life cycle in Marchantia polymorpha. (2015)
  • Author(s): Kato, H., Ishizaki, K., Kouno, M., Shirakawa, M., Bowman, J.L., Nishihama, R. and Kohchi, T.
  • Journal Title: PLoS Genetics Volume: 11 Pages: e1005084
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005084
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Conserved mechanism for secondary meristem formation in land plants (2016)
  • Author(s): Kimitsune Ishizaki
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
  • Invited
• [Presentation] Screen for regulatory proteins of schizogenous intercellular space formation in Marchantia polymorpha by using mass spectrometry and the CRISPR/Cas9 genome editing technology. (2016)
  • Author(s): Miya Mizutani; Kimitsune Ishizaki; Yoichiro Fukao; Masayuki Fujiwara; Akihide Masuda; Ryuichi Nishihama; Takayuki Kohchi
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [Presentation] Functional characterization of GCAM1, an R2R3-MYB essential for the development of gemma cup in the liverwort Marchantia polymorpha. (2016)
  • Author(s): Shigeyuki Tsukamoto; Tomomi Sugaya; Katsuyuki T. Yamato; Ryuichi Nishihama; Hiroyoshi Kubo; Hidehiro Fukaki; Tetsuro Mimura; Takayuki Kohchi; Kimitsune Ishizaki
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [Presentation] Characterization of KARAPPO, an essential gene for gemma formation in Marchantia polymorpha. (2016)
  • Author(s): Takuma Hiwatashi; Katsushi Yamaguchi; Shuji Shigenobu; Shinichiro Sawa; Hiroyuki Kirita; Hidehiro Fukaki; Tetsuro Mimura; Takayuki Kohchi; Kimitsune Ishizaki
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [Presentation] An ancient regulatory mechanism for secondary meristem formation in land plants (2015)
  • Author(s): Kimitsune Ishizaki
  • Organizer: Towards Increased Plant Productivity through Understanding of Environmental Responses and Epigenetic Regulation
  • Place of Presentation: 理研、横浜キャンパス（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2015-11-24 – 2015-11-25
  • Int'l Joint Research / Invited