2015 Fiscal Year Annual Research Report
病原性 IV 型分泌マシナリーの全構造解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Harmonized supramolecular machinery for motility and its diversity |
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| Project/Area Number |
15H01322
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
久堀 智子 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師(常勤) (20397657)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細菌 / 感染症 / ナノマシン / タンパク質分泌系 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レジオネラ dot/icm 遺伝子群に含まれる遺伝子の個々の欠失株からコア複合体の単離を行い、ネガティブ染色による透過型電子顕微鏡観察により、コア複合体の有無やすでに得られているコア複合体との構造比較を行った。その結果、コア複合体の形成には必須ではないが、コア複合体に相互作用して分泌系の一部として働く外膜コンポーネントタンパク質を見出すことができた。
研究代表者によってすでに確立されているレジオネラからネイティブなコア複合体を生化学的に単離する方法に改良を加え、クライオ電子顕微鏡などによる解析に十分な量と質の試料を調製することを計画していた。この目的のために、大腸菌にコア複合体構成タンパク質を発現させる系を構築し複合体形成を解析した。大腸菌発現系でタンパク質を十分量発現する系は構築できたものの、大腸菌の系では目的タンパク質の外膜へのソーティングがうまく起こらないことがわかり、正常な複合体の形成を誘導することができなかった。そのため、再び、レジオネラで目的タンパク質を発現させる系に戻り、収率を上げるために特定のタンパク質に精製のためのタグの付与を行った。タグをつけるタンパク質、タグの種類、付与する部位についての数多くの組み合わせをスクリーニングし、ようやく目的に叶いそうな発現系が構築されたところであり、精製に向けての実験を精力的に進めているところである。
また、クライオトモグラフィーによる Dot/Icm IV 型分泌系全体像の可視化を目指して、細胞内密度を下げるためのレジオネラのミニセル形成を試みた。ミニセル形成に有効であることが報告されている FtsZ 単独及び、FtsQAZ オペロンの大量発現系をレジオネラに導入したり、細胞分裂抑制に関わる MinC, MinD の欠損レジオネラ株を構築するなど様々な方法を試みたが、いずれの場合もミニセル形成が確認できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
複合体の構造解析に有効な大腸菌の発現系で構成タンパク質を発現させ複合体を形成させる試みが、様々な技術的改良にもかかわらずうまく機能しなかった。また、レジオネラの系に戻って、目的タンパク質の大量発現系を導入した場合も、発現量を適切に調節しないと正常な複合体が形成されないことが分かったため、精製の際の収率を上げることでこの問題点を解決しようと試みた。そのための特定タンパク質へのタグの付与についての条件設定の探索に時間を費やした。
また、クライオトモグラフィーによる観察に重要なミニセル形成において、様々なコンストラクトの構築や解析を行ったが、大腸菌やサルモネラなどの細菌で確立されている条件がレジオネラでは機能しないことがわかり、構造解析に進めることができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
コア複合体に相互作用して分泌系の一部として働くコンポーネントタンパク質を同定することができた結果を受けて、このタンパク質の IV 型分泌系の複合体形成における役割を構造的見地から明らかにすることに焦点を置いた解析を展開する。
レジオネラにコア複合体の発現系を導入する系を用いてタグによる精製条件の確立を行う。順調に進んだ場合は、当初の計画通りクライオ電子顕微鏡による単粒子解析に進め、より高解像度でのコア複合体の構造を明らかにする。
ミニセル形成に替わる方法として、レジオネラ内膜反転ベシクルの調整を試み、内膜部分複合体の構造をクライオトモグラフィーあるいは生化学的手法で解析する。
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