2015 Fiscal Year Annual Research Report
NADPHオキシダーゼ活性の時空間的定量法の確立
Publicly Offered Research
| Project Area | Oxygen biology: a new criterion for integrated understanding of life |
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| Project/Area Number |
15H01398
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
吉岡 博文 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 活性酸素 / リン酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) においては、NbRBOHBが病害応答性CDPKやRLCKによってリン酸化され、ROS生産を誘導する。本年度は、２種の蛍光タンパク質 (YFP、CFP)、NbRBOHB由来のリン酸化配列を用いて、CDPKまたはRLCKによるリン酸化によって生ずる構造の変化に伴って蛍光共鳴エネルギー移動 (Foster Resonance Energy Transfer: FRET) が起こる２つのセンサーの基本構造を構築し、FRET効率の最適化を図った。
FRETシステムは、センサーのリン酸化時と非リン酸化時で異なる波長の蛍光として観察されるため、CDPKまたはRLCKの活性化を生細胞で蛍光として観察できる。２遺伝子発現型バイナリーベクターをベースとして、作製したセンサーとエフェクターをそれぞれ35Sプロモーターの下流に挿入した。エフェクターには、病害応答性CDPKの恒常活性型変異体 (NbCDPK5VK) および非活性型変異体 (NbCDPK5VK-KM) を用いた。これらバイナリーベクターを、アグロインフィルタレーション法によってベンサミアナタバコに導入して発現させ、葉組織から粗抽出液を調製し、マルチプレートリーダーを用いてFRET蛍光 (YFP/CFP) の強度を評価した。しかし、現在までに良好なFRET蛍光は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度は、センサーの基本構造を構築し、FRET効率を最適化する目的で様々なコンストラクトを作製した。FRET強度比 (ON時/OFF時) が1.3以上であることが、実用レベルのセンサーの目安とされている。一過的発現系を用いてベンサミアナ葉でFRET強度比(NbCDPK5VK / NbCDPK5VK-KM)を測定した結果、これまでに基準値以上のセンサーが得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、センサーの構造を最適化する目的で、さらに多くのバリエーションを持たせたコンストラクトを作製し、FRET強度比が1.3以上であるセンサー構造を模索する。また、抗リン酸化抗体を用いた免疫ブロットによりセンサーのリン酸化を評価する。
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[Journal Article] Hierarchical regulation of NADPH oxidase by protein kinases in plant immunity.2016
Author(s)
Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Asai, S. and Yoshioka, M.
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Journal Title
Physiological and Molecular Plant Pathology
Volume: 95
Pages: 20-26
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] A receptor pair with an integrated decoy converts pathogen disabling of transcription factors to immunity.2015
Author(s)
Le Roux, C., Huet, G., Jauneau, A., Camborde, L., Tremousaygue, D., Kraut, A., Zhou, B., Levaillant, M., Adachi, H., Yoshioka, H., Raffaele, S., Berthome, R., Coute, Y., Parker, J.E. and Deslandes, L.
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Journal Title
Cell
Volume: 161
Pages: 1074-1088.
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Molecular characterization of LjABCG1, an ATP-binding cassette protein in Lotus japonicus.2015
Author(s)
Sugiyama, A., Fukuda, S., Takanashi, K., Yoshioka, M., Yoshioka, H., Narusaka, Y., Narusaka, M., Kojima, M., Sakakibara, H., Shitan, N., Sato, S., Tabata, S., Kawaguchi, M. and Yazaki, K.
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 10
Pages: e0139127
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] WRKY transcription factors phosphorylated by MAPK regulate a plant immune NADPH oxidase in Nicotiana benthamiana.2015
Author(s)
Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
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Journal Title
Plant Cell
Volume: 27
Pages: 2645-2663.
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Protein kinase-mediated regulation of NADPH oxidase in plant immunity.2015
Author(s)
Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Asai, S., Ishihama, N. and Yoshioka, M.
Organizer
11th US-Japan Scientific Seminar
Place of Presentation
香川
Year and Date
2015-10-26 – 2015-10-29
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] MAPK-WRKY pathway up-regulates NbRBOHB gene and contributes to effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana.2015
Author(s)
Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
Organizer
The 4th International Conference on Biotic Plant Interactions.
Place of Presentation
中国
Year and Date
2015-08-26 – 2015-08-29
Int'l Joint Research
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[Presentation] Transactivation of NbRBOHB gene via MAPK-WRKY pathway is essential for effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana.2015
Author(s)
Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Miyagawa, N., Yoshioka, M., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
Organizer
12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
Place of Presentation
イタリア
Year and Date
2015-05-24 – 2015-05-27
Int'l Joint Research
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[Presentation] RLCK-mediated phosphorylation of the N-terminus of RBOH regulates ROS burst in rice.2015
Author(s)
Yoshioka, M., Yamaguchi, K., Fujiwara, M., Yoshimura, S., Kawasaki, T. and Yoshioka, H.
Organizer
12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
Place of Presentation
イタリア
Year and Date
2015-05-24 – 2015-05-27
Int'l Joint Research
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