プロテアソームによるポリユビキチン化タンパク質分解過程の過渡的複合体の解析

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 15H01627
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: プロテアソーム / 高速AFM

Outline of Annual Research Achievements

２６Sプロテアソームは、細胞内で迅速かつ選択的にポリユビキチン化タンパク質の分解を行い、様々な細胞機能調節に関与する。本研究はプロテアソームのATP依存的な基質タンパク質の分解過程を高速AFMでの直接観察を目的とし、実験を行った。これまで、酵母プロテアソームの高速AFM観察には成功し、主として分解過程の最初の段階のプロテアソームと基質タンパク質との複合体観察を実施した。AFM観察における良好な画像取得には、サンプルの基板固定条件が重要である。これまでに、２６Sの構造を観察するためにはアミノシラン修飾基板が適していることがわかっていたが、この基板では基質の非特異的吸着などの問題が生じ、基質との複合体観察頻度が非常に低く、研究進度が上がらなかった。また、基板上のプロテアソームの活性が保証できておらず、複合体観察に適した基板修飾を検討した。基板表面のプロテアソームの活性評価には、全反射蛍光顕微鏡による１分子観察系を用い、基板表面に固定したプロテアソームへの蛍光標識ATPの結合/解離を評価した。その結果、アビジンを介してPEG修飾基板に固定した基板上のプロテアソームにATPase活性があることを確認できた。さらにそれら解析からプロテアソーム中のAAAサブユニット間の共同的な加水分解反応を示唆するデータが得られた。しかし、PEG修飾基板に固定したプロテアソームの結合強度が低いためか、高速AFMでのプロテアソーム観察には適していないことが判明し、結合強度を高めることを検討する。上記の基板固定方法では、プロテアソームの基質結合部位(１９S)を基板が物理的に阻害する可能性があるため、基質結合部位を上向きに固定する方法を検討し、その第一段階となる酵母２０Sの基板固定が可能であることを示すことができ、今後基板上の２０Sへの１９Sの再構築への手がかりを得ることができた。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。