2016 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質複合体内部の距離と角度の変化をリアルタイムで捉える蛍光計測法の開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01630
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
須河 光弘 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (80626383)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2017-03-31
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| Keywords | 分子モーター / 構造機能相関 / １分子計測 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子モーターの動作原理を理解する上で化学-構造-力学の三者共役の理解が不可欠である。回転分子モーターF1-ATPase（以下F1）はその動作原理の解析が最も進んでいる分子モーターの一つであるが、２０種以上の結晶構造が解かれたにも関わらずATP結合待ちの構造が同定されておらず、このことが三者共役理解のネックとなっていた。そこで、１分子計測によるATP結合待ち構造の特徴抽出と主成分分析(PCA)による結晶構造の系統的構造比較を用いて、F1のATP結合待ち構造の同定を行い、さらにATP加水分解反応-構造遷移-回転運動の三者共役モデルを提案した。
この三者共役モデルを検証するためにF1のサブユニットであるαとβの界面の動きを計測することを目指した。隣り合う２つのαサブユニットとβサブユニットの界面の動きを捉えるために偏光FRET法を考案し、研究を進めた。Cy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成し、αサブユニットにdouble cys変異を導入したF1およびdouble cys変異を導入したβサブユニットを単独で発現・精製し、Cy3-bis-βおよびF1(Cy5-bis-α)を作成した。Cy3-bis-βとF1(Cy5-bis-α)を高塩濃度環境下で混合し、サブユニットの交換反応を起こすことでF1(Cy5-bis-α/Cy3-bis-β)を得た。このF1(Cy5-bis-α/Cy3-bis-β)を用いて１分子偏光FRET計測を行った。まだプレリミナリーな結果だが、αβ界面の動きを反映したと考えられるFRET効率の変化が観察された。現在、計測条件の最適化とデータ解析を進めている。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(3 results)
