2016 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質ポリマー形成による動的膜形態形成の直接可視化による解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01641
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
末次 志郎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (70345031)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞生物学 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内及び試験管内の多量体形成の可視化： 多量体においては、タンパク質が高密度で存在する。超解像観察では、個々の分子に導入したラベルの離散的な発光により観察を行うため、ラベルの導入効率が問題となる。離散的な発光の可能な蛍光タンパク質(EOSなど)の融合タンパク質をCRISPR/Cas9システムによりノックアウトした細胞株にレトロウイルスを用いて安定的に導入することで、すべての観察対象の分子がラベルされている状況を作り出すことができた。その結果、非常に高密度のBARドメインタンパク質の細胞内局在を可視化できた。その密度はサブマイクロモル濃度であり、また分子の距離が互いに２０nm以内で密に並んでいることが示唆された。
BARドメイン同士の多量体形成の構造基盤： BARドメインは、６本のアルファヘリックスバンドルからなる２量体である。一部のBARドメインには、アルファヘリックスバンドルから飛び出たループが存在する。一部のBARドメインでは、このBARタンパクドメインの一部には、疎水的でないループが存在し、結晶内でのタンパク質同士のコンタクトサイトとなっていた。この結晶の中で見られた相互作用部位に変異度導入したところ、細胞内での局在と脂質膜への試験管内での結合が失われた。このことから多量体系性は、脂質膜とBARドメインタンパク質の結合に重要であることが示された。
試験管内のBARドメインタンパク質による脂質膜チューブ形成の開始過程と伸長過程の可視化： 顕微鏡下での観察に適した大きなリポソーム（GUV）の作成を行い、その表面におけるBARタンパク質の集積の可視化に成功した。今後のこの集積の時間変化を詳しく調べる予定である。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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