2016 Fiscal Year Annual Research Report
Designed Chemical Probes for Clarification of Biological Function of Target Molecules
Publicly Offered Research
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
|---|
| Project/Area Number |
16H00768
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 化学プローブ / タンパク質ラベル化 / 1分子イメージング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞内生体分子を時間と空間を制御して可視化し、細胞レベルで機能解明を行う。この分野で汎用されている蛍光蛋白質を用いた系では、その発現タイミングや発現強度の制御は容易ではなく、詳細な時間と局在解明に対応した技術を創り出す研究は皆無であった。この状況下、研究代表者は測定したい分子との反応に着目して化学プローブをデザインするという発想を基に、時間を特定して標的蛋白質に蛍光団を導入する原理を開発し、分子認識、酵素反応を分光情報（蛍光特性変化等）へと変換できるプローブをデザイン・合成し、生物応用に成功してきた。本研究では、分子プローブの機能を向上させ、生命分子機能を時空間を制御して解明するための基礎研究を推進する。具体的には細胞内蛋白質への機能プローブ導入法を1分子イメージングなどに展開する。上記の目的を達する蛋白質の機能性分子ラベル化技術を開発し、動的秩序解析の基礎技術を確立する。
本年度においては多色1分子イメージングを実現するために、近赤外領域に蛍光を有するプローブの開発に着手した。近赤外蛍光色素として、Ｓｉローダミンを選択し、変異体ベータラクタマーゼタグ（ＢＬタグ）を用いた蛋白質ラベル化プローブを開発した。近赤外色素は脂溶性が高く、１分子イメージングを行う際に非特異的な吸着に由来するバックグラウンドシグナルが現れる問題があったため、水溶性のリンカーをプローブに導入した。この導入により、バックグラウンド蛍光を抑えたイメージングが可能となった。加えて、リンカー長を調節することで細胞膜透過性を維持し、細胞内蛋白質に対しても効率よくラベル化することが可能となった。このプローブを市販のＨａｌｏタグと併用し、自然免疫系に関与するＴＬＲ４、ＴＩＲＡＰを2色でラベル化し、蛋白質間相互作用を1分子レベルで観察し、定量的な解析を可能とした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1分子イメージングを用いたタンパク質の動態を時空間的に解析するという目標に対し、実際に細胞膜を高効率で透過する分子プローブを作製し、低濃度で培養液に加えることで標的タンパク質に特異的に蛍光標識できる技術の開発に着手した。この過程において、適切なレーザー光耐性、そして励起光波長域を有する色素として近赤外蛍光色素であるSiローダミンを選択した。しかしながら選択した近赤外色素は脂溶性が高く、プローブを用いた１分子イメージングを行う際に非特異的な吸着に由来するバックグラウンドシグナルが現れる問題に直面した。従来水溶性の向上には負電荷を有するスルホ基の導入が行われてきたが、この導入によりプローブの細胞膜透過能が失われるため両立しない。そこでプローブの色素とBLタグリガンドとの間に水溶性のリンカーを導入したところ、細胞内のタンパク質を高い選択性でラベル化できることを見出した。1分子イメージングが可能な細胞内タンパク質のラベル化には水溶性リンカーの長さが特に重要であり、その最適化が必要であった。その結果として、市販のHaloタグとBLタグとを併用した2色ラベルによる1分子イメージングによって、自然免疫系に関与するタンパク質間相互作用を可視化し、その動態を解析することが可能となった。本研究により得られた分子プローブ設計の指針は、他の細胞内タンパク質のラベル化にも応用可能であり、当初の計画以上の成果が得られたものと考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後においては、ＤＮＡメチル化・ヒドロキシルメチル化をイメージングする蛍光プローブを開発し、ＤＮＡメチル化動態について観察を行う。核内のＤＮＡメチル化部位を高精度かつ簡便に検出する技術を開発する。当研究室で開発したＰＹＰタグによる蛋白質ラベル化手法を用いて、メチル化ＤＮＡに結合したときのみ蛍光を発するプローブを合成する。本手法では特に、ＤＮＡに結合したときのみに蛍光が上昇するＤＮＡ結合色素、オキサゾールイエローをプローブの色素として用いることで、バックグラウンド蛍光を抑えたイメージングが可能になると期待できる。
まずは上記の設計指針に従って合成した小分子がＰＹＰタグを介したＤＮＡメチル化結合蛋白質と超分子複合体を形成するかどうかを調べていく。その後、この小分子―蛋白質複合体がメチル化ＤＮＡに特異的に結合するかどうか、またその際に蛍光が上昇するかどうかを評価する。DNA結合や蛍光増大に問題が生じる場合、蛋白質間のリンカーやオキサゾールイエローとPYPリガンドの間のリンカー構造を最適化することで問題を解決する。最終的に超分子プローブを生細胞イメージングに応用し、ＤＮＡメチル化・ヒドロキシメチル化の状態を可視化し、時空間的な解析を行う。この技術を用いて、細胞分裂・分化におけるDNAメチル化の経時変化や空間的配置を生細胞で可視化することで、エピジェネティックな遺伝情報が、細胞分裂・分化に伴い継承される過程を解明する。
|
Research Products
(8 results)
-
-
-
-
-
[Journal Article] Fabrication of ‘Clickable’ Polyfluorene Nanowires with High Aspect Ratio as Biological Sensing Platforms2016
Author(s)
T. Wasin, K. Enomoto, T. Sakurai, V. Padalkar, H. Cheng, M. Tang, A. Horio, D., Sakamaki, M. Omichi, A. Saeki, K. Kikuchi, Y. Hori, A. Chiba, Y. Saito, T. Kamiya, M. Sugimoto, S. Seki
-
Journal Title
ACS Sensors
Volume: 6
Pages: 766-774
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
