2016 Fiscal Year Annual Research Report
染色体上の非コードRNAが動的クロマチン構造を制御する仕組み
Publicly Offered Research
| Project Area | Dynamic chromatin structure and function |
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| Project/Area Number |
16H01309
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
平岡 泰 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (10359078)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは、分裂酵母の減数分裂において、非コードRNA であるmeiRNAが染色体の特定の部位sme2遺伝子座に蓄積し、減数分裂に必須な相同染色体の対合に寄与することを発見した。本研究は、染色体上のsme2遺伝子座に蓄積したmeiRNAの結合タンパク質を同定し、その役割を理解することによって、クロマチン機能における非コードRNAの機能を明らかにすることを目的とする。
これまでに、分裂酵母のGFP融合タンパク質ライブラリを利用してmeiRNAと共局在する因子を検索し、減数分裂期に特有に染色体上のsme2遺伝子座に蓄積するタンパク質の候補を同定した。蛍光融合タンパク質の局在を顕微鏡で検索することによって、sme2遺伝子座に蓄積する因子を10個選別し、sme2 RNA binding protein (Smp)と名付けた。さらに、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を作成した。これを用いて、コヒーシンなどの変異体でクロマチン構造をイメージングすると共に、sme2遺伝子座の対合への影響を解析した。平成28年度は、高分解能でクロマチン構造を観察するために、超分解能顕微鏡法として3D-SIM (Structured Illumination Microscope)を用い、分裂酵母のクロマチン構造の解析を可能にした(Matsuda et al., Yeast, 2016)。これによりコヒーシンが作るクロマチン構造が相同染色体対合に必須であることを示したDing et al., Chromosoma, 2016; Ding et al., Curr. Genet., 2016)。また、分裂酵母のヒストンを用いたヌクレオソーム再構成を実現し、その生化学的特性を解析した（Koyama et al., BBRC, 2017）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GFP融合タンパク質ライブラリを利用したmeiRNA共局在因子の網羅的的解析により、meiRNAと共局在する因子を選別することができ、さらにこの中から相同染色体の対合に影響する因子を同定した結果、polyA付加などRNA代謝反応に関与するタンパク質が得られた。また、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を作成したことにより、染色体の約１３０箇所を生細胞可視化した。このような細胞株は、本課題の目的だけでなく、染色体のダイナミクスを研究する様々な実験に活用できる有用な資源となっている。
このような染色体と細胞核ダイナミクスの研究の成果を国際学術誌に発表するとともに、超分解能顕微鏡法3D-SIM技術支援や分裂酵母の生物資源の共用を通して、領域内連携に貢献している。胡桃坂らとの領域内連携として、分裂酵母のヒストンを用いたヌクレオソーム再構成を実現し、その生化学的特性を解析し、論文を発表した(Koyama et al., BBRC, 2017)。さらに木村らとの領域内連携として、ヒストン修飾の可視化に関する論文を発表した(Sato et al., J. Mol. Biol., 2016)。
これらのことから、研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、分裂酵母減数分裂期に特有に染色体上のsme2遺伝子座に蓄積するタンパク質として、10個のsme2 RNA binding protein (Smp)を同定した。今後は、これらのSmpタンパク質のクロマチン動態への影響を見るために、Smpタンパク質遺伝子の変異株で相同染色体の対合を生細胞蛍光イメージングにより観察する。また、Smpタンパク質の結合サイトを同定するために、蛍光融合Smpタンパク質の局在を解析し、特定の部位に局在が見られる場合、GFP融合したSmpタンパク質を用いて減数分裂期のChIP-chipあるいはChIP-seqを行い、Smpタンパク質の染色体結合部位を同定する。これと並行して、分裂酵母ゲノムの150箇所の場所それぞれにlacOリピートを挿入した株を活用し、蛍光顕微鏡による網羅的な検索を行う。これら一群の株においては、lacOリピートが互いに約100kb離れた間隔で、ゲノム全体にわたり挿入されている（１株あたり１箇所の挿入、全150株）。それぞれの株でmCherry 融合Smpタンパク質を観察し、どの染色体部位に局在するか、蛍光顕微鏡で探索する。
これらSmpタンパク質因子のうち、ポリA付加や染色体蓄積に影響が確認されたものに対して、さらにこれに結合するタンパク質を、プロテオミクス解析やyeast two-hybrid法を用いて同定し、RNAタンパク質複合体を網羅的に同定する。これらの因子に対して遺伝子破壊株または機能低下変異株を作成し、sme2遺伝子座の対合に対する影響を解析する。さらに、これらの細胞株において、超解像イメージングや電子顕微鏡によりクロマチン構造を解析し、クロマチン構造への影響を検討する。
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[Journal Article] Inner nuclear membrane protein Lem2 augments heterochromatin formation in response to nutritional conditions.2016
Author(s)
Tange Y, Chikashige Y, Takahata S, Kawakami K, Higashi M, Mori C, Kojidani T, Hirano Y, Asakawa H, Murakami Y, Haraguchi T, Hiraoka Y.
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Journal Title
Genes to cells
Volume: 21
Pages: 812-832
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] A genetically encoded probe for live-cell imaging of H4K20 monomethylation.2016
Author(s)
Sato Y, Kujirai T, Arai R, Asakawa H, Ohtsuki C, Horikoshi N, Yamagata K, Ueda J, Nagase T, Haraguchi T, Hiraoka Y, Kimura A, Kurumizaka H, Kimura H.
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Journal Title
Journal of molecular biology.
Volume: 428
Pages: 3885-3902
DOI
Peer Reviewed
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