2016 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム反復配列の核内テーミング
Publicly Offered Research
| Project Area | Chromosome Orchestration System |
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| Project/Area Number |
16H01411
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
山中 総一郎 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (80711845)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | トランスポゾン / ゲノム編集技術 / 生殖細胞 / ATAC-seq / 反復配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、トランスポゾンなどに代表されるようなゲノム上の反復配列の生物学的意義を統合的に解析する手法を開発してきた。具体的には、TALENやCRISPR/Cas9などのゲノム編集技術を応用して特定のゲノム領域のみを特異的に細胞から回収することを目指している。系の確立のために、リピート配列によって構成されるゲノム構成配列である、セントロメアやテロメアをターゲットに実験を進めた。まず初めに、それぞれの領域をターゲットするTALEコンストラクトを構築し、これらにVenus配列とflag配列を付加させた。さらに、このコンストラクトを恒常的に発現する細胞株を単離した。この細胞株から抗Venus抗体と抗flag抗体とで２回連続的に免疫沈降したところ、ネガティブコントロールローカスと数万倍のシグナルノイズ比が得られた。現在、細胞数を大幅に増やして免疫沈降を行って得られたサンプルを質量分析にかけている段階である。
以上の手法開発に加えて、それを利用する対象を現在開拓している。これまでに、マウスの雄性生殖細胞のクロマチン環境をATAC-seq法によって解析した。まずその解析のために必要なマウスの取り寄せや、生殖細胞だけを分取するFACSの条件検討、さらに数万程度の少量の細胞からATAC-seqライブラリーを作製するためのプロトコルの改善等を行った。それにより、マウスの生殖細胞におけるクロマチン状態変化を時系列的にプロファイルすることに成功した。その結果、特定のトランスポゾンが数メガベースに渡って密集しているゲノム領域においてアクセシビリティが一過的に上昇することが明らかとなった。さらにこの現象を詳細に明らかにするために、ダイナミックにクロマチン状態が変化する時期の生殖細胞におけるトランスクリプトームを明らかにしようとしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究においては、クロマチン状態を統合的に解析する手法の開発を目指している。これと同時に申請者は、手法開発とともにそれを実際に利用する対象となるような生命現象を探索してきた。
手法開発の部分に関しては、免疫沈降を２回行うことで得られた沈降産物に以前よりも非特異的な物質の混入を低くすることに成功した。さらにタグタンパク質の免疫沈降時に用いる抗体のモノクローナル抗体を作出した。これにより、以前よりも質の高い抗体を免疫沈降に用いることができ、さらに抗体に対してかかった経費を低く抑えることが可能になった。よって現在この改善されたプロトコルを用いて、質量分析に供するサンプルを調製している。
上述の手法を利用できる対象として、マウス生殖細胞のクロマチンを構想している。現在までにマウス生殖細胞のクロマチン状態を時系列に沿ってプロファイルする系を確立した。その結果得られたデータを解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
「クロマチン状態を統合的に解析する手法」に関しては引き続き、条件検討と大量細胞からのサンプル調整を行っていく。その結果、遺伝子座特異的に存在するタンパク質が見られた場合、それらの分子生物学な解析を行う。
「マウス生殖細胞のクロマチン」に関しては、ATAC-seqによる分析がほぼ済んでいる。よって、今後H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3といった主要なヒストン修飾に関してChIP-seqを行う。さらに、各分化段階におけるトランスクリプトームをCAGE-seqによって明らかにする。
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Research Products
(2 results)
