2017 Fiscal Year Annual Research Report
Acceleration of the development of safe and effective transfection methods by tissue optical clearing
Publicly Offered Research
| Project Area | Resonance Biology for Innovative Bioimaging |
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| Project/Area Number |
16H01431
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
麓 伸太郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (70380988)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞・組織 / 組織透明化 / 可視化 / 空間分布 / 遺伝子導入法 / 酸化ストレス / リポソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は組織透明化により開発したDDSキャリアの組織中空間分布を評価することを想起し、リポソームなどのDDS製剤の評価法として適する組織透明化法として、脂質膜を保持しつつ、充分な透明化効率を発揮する新規組織透明化試薬Seebestを開発している。Seebestは脂溶性カルボシアニン色素DiIによる血管染色に対応し、脂質構造が電顕レベルで保持でき、リポソームの組織中空間分布も解析可能であるため、DDS評価に適することが示されている。さらに、pHも調整可能であり、ドキソルビシンの組織中空間分布評価を行い、pHを調整することで透明化中のドキソルビシンの組織からの漏出を抑えつつ、蛍光強度を高めることで、心臓、肝臓、腎臓において、細胞核に集積したドキソルビシンの可視化に成功した。
Seebestは組織透明化スピードも高く、有益な方法であるが、低波長域に光吸収、自家蛍光があることが問題であった。そこで、Seebestに用いるポリエチレンイミンの構造を改変することで、低波長域の光吸収および自家蛍光を低減し、DAPIによる核染色パフォーマンスを増大することができた。
Seebestでは、膜を保持するため、そのままでは抗体染色に対応できない。しかし、Seebestに浸漬した組織を洗浄し、薄切して抗体染色を行ったところ、チューブリンを観察できたことから、抗原性は保持していることが確認された。そこで、一度蛍光を観察した後、一部の色を抜き、透過処理を施して抗体染色した後、もう一度同じ箇所を観察する方法として、三次元光顕・光顕相関法（C2LM）を考案した。脂溶性カルボシアニン色素の洗浄と酸化ストレスマーカーCellROX deep redのフォトブリーチにより、一度観察した色を抜くことには成功したが、抗体の染色がうまくいかなかった。今後、さらに三次元抗体染色について検討を行う予定である。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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