2017 Fiscal Year Annual Research Report
発達に伴うモノアミンニューロンの代謝シフト機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Mechanisms underlying the functional shift of brain neural circuitry for behavioral adaptation |
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| Project/Area Number |
17H05555
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
一瀬 宏 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (90192492)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ドパミントランスポーター / チロシン水酸化酵素 / ドパミンβ水酸化酵素 / 神経終末 / 直接路 / 間接路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、これまでに神経終末でのドパミン量の調節が、幼若期には生合成経路の活性により変化するが、成獣では生合成酵素活性に依らずに一定に保たれることを見出している。このようなドパミン代謝の変化が、大脳基底核神経回路の重要な神経回路である直接路と間接路による行動制御のシフトとどのように結びついているかを解明することを目的として研究を進めている。
神経終末でのドパミン量は、生合成量と分解活性、さらに、小胞内への取り込み量や小胞から細胞外への放出頻度、細胞外から神経終末への再取り込みなど、多くの要因により変化する。細胞外ドパミンを神経終末に再取り込みするドパミントランスポーターを発現するアデノ随伴ウィルス(AAV-DAT)を、自治医科大学の村松慎一教授らと共同で作製した。今後、AAV―DATをマウス成獣および新生仔の中脳に投与することにより、神経終末の存在する線条体のドパミン量がどのように変化するか解析する。
また、synaptic boutonsを可視化・定量するために、モノアミン小胞内に局在するドパミンβ水酸化酵素(DBH)のシグナルペプチドと蛍光タンパク質EGFPを融合させた遺伝子(DBHsp-EGFP)を作製して、培養細胞内で発現させてEGFPが神経終末に局在するか解析した。ヒト神経芽細胞腫由来細胞であるSH-SY5Y細胞にトランスフェクションしたところ、蛍光シグナルを細胞体の細胞膜や神経突起先端に観察することができた。さらに、神経終末に局在するDATを利用してEGFPを神経終末に局在させるために、様々な長さのDATタンパク質にEGFPを融合させるコンストラクトを作製した。培養細胞での発現を解析した結果、一部のコンストラクトでEGFPによると考えられる蛍光シグナルを、神経末端で観察することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者は、本研究において「線条体ドパミンを一定に保つための調節機構と発達過程での代謝シフト機構の解明」と「モノアミンニューロンのsynaptic boutonsを可視化・定量する手法の開発」の主に２つのプロジェクトを遂行している。線条体ドパミンの代謝シフトを解明するために、細胞外ドパミンを神経終末に再取り込みするドパミントランスポーターのマウス遺伝子をクローニングした。それから、細胞内に遺伝子を効率よく導入するために、AAVベクターにDAT遺伝子を組み込んだ。AAV-DATは、自治医科大学の村松慎一教授らと共同することにより作製した。
ドパミン生合成に必須なテトラヒドロビオプテリン(BH4)の生合成酵素であるGTPシクロヒドロラーゼI (GCH)をAAVに組み込んだAAV-GCHを中脳に投与する実験も行った。当初、ドパミンニューロン内BH4の増加により、ドパミンが増加することを想定したが、予想に反してドパミンが低下した。なぜドパミンが減少したか調べるために、中脳のドパミンニューロンを組織化学的手法により解析したところ、顕著な神経変性像が観察された。なぜ、AAV-GCH投与によりドパミンニューロンが変性するか、追求していきたい。
また、synaptic boutonsを可視化・定量するために、モノアミン小胞内に局在するドパミンβ水酸化酵素(DBH)のシグナルペプチドと蛍光タンパク質EGFPを融合させた遺伝子(DBHsp-EGFP)を作製して、培養細胞内で発現させてEGFPが神経終末に局在するか解析した。ヒト神経芽細胞腫由来細胞であるSH-SY5Y細胞にトランスフェクションしたところ、蛍光シグナルを細胞体の細胞膜や神経突起先端に観察することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
神経終末のドパミンが、シナプス後のドパミン受容体を介するシグナルにより調節されている可能性を解析するために、ドパミンD1受容体およびドパミンD2受容体のfloxマウスを用いて解析する。ドパミンD1受容体とD2受容体は、それぞれ直接路および間接路を司る神経回路に特異的に発現している。loxP配列を認識して遺伝子組換えを起こすCreリコンビナーゼ(AAV-Cre)を線条体に投与して線条体のD1遺伝子だけを破壊することにより、線条体ドパミンおよびTHタンパク質量がどのように変化するか解析する。
AAV-GCH投与によるドパミンニューロン変性機構の解析では、中脳でBH4が増加することによりどのような細胞内シグナルの変化が起こるのか、一酸化窒素代謝との関連を追求する。一酸化窒素合成酵素は、BH4を必要とする酵素であり、BH4量により酵素活性や酵素のダイマー・モノマーの比率が変化するといわれている。パーキンソン病におけるドパミンニューロンの変性に、BH4代謝が関与している可能性について明らかにできる可能性がある。
また、新規合成されるドパミンと、細胞外から再取り込みされるドパミンを区別するために、安定同位体を用いてドパミン代謝のフラックス解析を行う。幼若期から成獣になるにつれて、ドパミン代謝がどのように変化するかを解析し、直接路間接路の発達変化との関連を解析する。
さまざまな長さのDAT遺伝子とEGFPを融合させたコンストラクトをさらに作成し、SH-SY5Y細胞に発現させて、EGFPシグナルを感申する。さらに、観察された蛍光シグナルがシナプスマーカーとして使われているSynapsinIと共局在するか検討する。
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