2017 Fiscal Year Annual Research Report
Action mechanism of CRISPR-Cas9
Publicly Offered Research
| Project Area | Neo-taxonomy of noncoding RNAs |
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| Project/Area Number |
17H05592
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (00467044)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR-Cas / 高速AFM / 結晶構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
II型CRISPR-Cas系にかかわるRNA依存性ヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的となる二本鎖DNAを切断する。近年、Cas9を利用した多くの新規技術が開発され、幅広い分野において利用されている。Cas9単体、Cas9-ガイドRNA複合体、Cas9-ガイドRNA-標的DNA複合体の結晶構造から、Cas9によるDNA切断の分子機構が明らかになってきた。さらに、これらの結晶構造の比較から、RNAやDNAの結合に伴うCas9の構造変化が示唆されている。しかし、そのダイナミクスは完全には解明されていなかった。本研究では、高速原子間力顕微鏡（AFM）を用いることにより、CRISPR-Cas9による標的DNAの切断反応をリアルタイムの分子動画として撮影することに成功した。高速AFMを用いた解析の結果、Cas9単体は柔軟な構造をとる一方、Cas9-ガイドRNA複合体は安定な構造をとることが明らかになった。さらに、DNA切断を担うHNHドメインが大きく揺らぎ、DNAの切断部位に移動したのち、切断されたDNAがCas9-ガイドRNA複合体から離れる瞬間を捉えることに成功した。
V型CRISPR-Cas系に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas12aは、Cas9と相補的なゲノム編集ツールとして利用されている。Cas12aはTTTVという配列をPAMとして認識するが、最近の研究により、Cをふくむ配列もPAMとして認識されることが明らかになってきた。しかし、Cas12aが複数の異なる配列をPAMとして認識する分子機構は不明であった。本研究では、4種類の異なるPAM配列をふくむCas12a-ガイドRNA-標的DNA複合体の結晶構造を決定し，Cas12aによる寛容なPAM認識機構を明らかにした。また、異なるPAM配列を認識するCas12a改変体（RVR改変体およびRR改変体）の作製に成功した。さらに、Cas12a改変体の結晶構造を決定し、そのPAM認識機構を解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
高速AFMを用いることにより、CRISPR-Cas9のダイナミクスを世界にさきがけて解明し、大きな反響をよんだため。
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| Strategy for Future Research Activity |
高速AFMおよび結晶構造解析を用いて、CRISPR-Cas12aによるDNA切断機構の解明を目指す。
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Research Products
(11 results)
