2018 Fiscal Year Annual Research Report
Action mechanism of CRISPR-Cas9
Publicly Offered Research
| Project Area | Neo-taxonomy of noncoding RNAs |
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| Project/Area Number |
17H05592
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00467044)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し、ガイドRNAと相補的な2本鎖DNAを選択的に切断する。したがって、Cas9を用いることにより、ゲノムDNAの狙った位置を切断し、その周辺の塩基配列を改変すること（ゲノム編集）が可能である。しかし、Cas9が標的DNAを認識するためには、ガイドRNAと標的DNAとの間の相補性にくわえ、PAMとよばれる特定の塩基配列が必要である。ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9（SpCas9）はNGG（Nは任意の塩基）という塩基配列をPAMとして必要とするため、ゲノム編集の適用範囲には制限が存在していた。そこで、SpCas9に7つのアミノ酸変異を導入することにより、NGGにくわえ、NGA、NGT、NGCをPAMとして認識するCas9改変体（SpCas9-NG）を作製した。SpCas9またはSpCas9-NGとガイドRNAをヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位への変異の導入を調べた。SpCas9はNGGをPAMとしてもつ標的部位に効率よく変異を誘導した一方、NGTおよびNGCをPAMとしてもつ標的部位には変異を誘導しなかった。SpCas9と対照的に、SpCas9-NGはNGGだけでなくNGHをPAMとしてもつ標的部位に変異を誘導した。さらに、SpCas9-NG（D10A変異体）とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質（Target-AID-NG）をヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位の塩基置換を調べた結果、Target-AID-NGはNGNをPAMとしてもつ標的部位に塩基置換を誘導することが明らかになった。以上の結果から、SpCas9-NGを利用することにより、ゲノム編集の適用範囲を従来の約4倍に拡張することに成功した。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space2018
Author(s)
Nishimasu Hiroshi、Shi Xi、Ishiguro Soh、Gao Linyi、Hirano Seiichi、Okazaki Sae、Noda Taichi、Abudayyeh Omar O.、Gootenberg Jonathan S.、Mori Hideto、Oura Seiya、Holmes Benjamin、Tanaka Mamoru、Seki Motoaki、Hirano Hisato、Aburatani Hiroyuki、Ishitani Ryuichiro、Ikawa Masahito、Yachie Nozomu、Zhang Feng、Nureki Osamu
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Journal Title
Science
Volume: 361
Pages: 1259～1262
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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