2017 Fiscal Year Annual Research Report
過渡的に形成されるDNA結合タンパク質多量体の動的構造の蛍光１分子イメージング
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
17H05892
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| Research Institution | The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries |
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Principal Investigator |
横田 浩章 光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 准教授 (90415547)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質・核酸の構造・動態・機能 / 蛍光1分子イメージング / 磁気共鳴 / ナノ計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA複製・修復・組み換えは、種の遺伝的連続性を保証する最も重要な機構である。これまで、これらの機構に関与する数々のタンパク質の同定と構造解析がなされ、詳細な生化学的解析に基づいて反応機構のモデルが提唱されてきた。一方、実際これらのタンパク質が機能する多数のサブユニットからなる複合体の3次元構造やダイナミクスに迫ること困難なこともあり、様々なタンパク質分子の相互作用ダイナミクスについては不明な点が多く残されている。
そのダイナミックなプロセスの理解には、直接タンパク質が機能している現場を可視化することが鍵となると考え、これまでDNA結合タンパク質1分子を直接イメージングしてきた。大腸菌のDNA修復機構で機能する非六量体型ヘリカーゼUvrDについては、単量体ではなく二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている。本研究では、このヘリカーゼがDNAを巻き戻す際に形成する過渡的な多量体の動的構造を蛍光1分子イメージングで解明することを目指している。
平成29年度は、UvrDの多量体のタンパク質－タンパク質間相互作用の構造ダイナミクスとDNA巻き戻し活性の関係を探るために、UvrD間の1分子FRETの観察を行った。さらに、システイン残基を1つだけもつ、C末のアミノ酸を欠如させた変異体とDNA巻き戻し活性が高い変異体を発現・精製・蛍光標識も行い、DNA上での多量体形成を蛍光1分子イメージングした。
また、UvrDの多量体構造の光検出磁気共鳴（ODMR）による解明に向けて、蛍光ダイヤモンドナノ粒子の表面修飾、ビオチン－アビジン系を利用したUvrDの蛍光ダイヤモンドナノ粒子標識を行った。ストレプトアビジンPEGコート蛍光ダイヤモンドナノ粒子を作製し、ヘリカーゼUvrDに標識し、そのDNAへの結合の蛍光1分子イメージングを試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UvrDの特異的蛍光標識がうまくいった一方、ODMR計測には改善の余地があるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
1分子FRETイメージングに関しては、ヘリカーゼUvrDのDNA上での多量体形成の様子をみながら、C末アミノ酸やDNA巻き戻し活性の高いUvrDの構造状態を1分子イメージングする。
光検出磁気共鳴（ODMR）イメージングに関しては、構築した顕微鏡と標識したヘリカーゼUvrDを用いて、蛍光1分子イメージングを実現し、DNA巻き戻しの際に形成されるヘリカーゼUvrDの多量体のDNA上での構造や動きを詳しく調べる。
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