2018 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of bacterial heme transporter
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
17H05896
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (90344043)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ヘム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アデノシン三リン酸（ATP）は生体でエネルギーのやりとりを媒介している。病原性バクテリア由来が持つタンパク質であるヘムインポーターも、ATPのエネルギーを駆動力としてヘムをペリプラズムから細胞質への膜輸送を行っている。インポーターのヌクレオチド結合サブユニットへのATP結合や加水分解反応がトランスポーターの膜貫通領域や全体構造の動きとどのように共役しているのかという基本的な現象の作動原理について明らかにすることを目的としている。通常の構造解析によってヘムの非結合型の結晶構造の決定に成功しているが、X線自由レーザーを用いた動的結晶構造を行うための技術基盤開発を行った。また、ヘム結合型の結晶を得ることが困難なことから、溶液状態での解析が可能なクライオ電子顕微鏡法による構造決定を目指してサンプル調製方法の最適化を行った。界面活性剤を用いて二つの膜貫通ドメイン（TMD）と二つのヌクレオチド結合ドメイン（NBD）からなる複合体を可溶化し、Ni-NTAカラム上でPBPとの複合体を形成させた。カラムから溶出させたPBP-TMD-NBD複合体をゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製後の試料の可視吸収スペクトルはSoret帯に吸収極大を示すことから、ヘム結合型であることを確認した。ネガティブ染色した試料を透過型電子顕微鏡による画像撮影によってヘムインポーターと同程度のサイズの粒子が多数観察されたことから安定な状態であることが確認できた。さらに、連携研究者と共同で計算機科学の手法を用いて動的性質を明らかにするために、ヘムインポーターとその周りの生体膜や水分子を模した全原子モデルを再現し、ATP結合の過程をシミュレートした。その結果、大規模な構造変化の過程が明らかとなった。そしてATPの加水分解反応が適切なタイミングで起こるためのタンパク質の制御メカニズムを提案した。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation sensitive metalloproteins2019
Author(s)
Ebrahim, A., Moreno-Chicano, T., Appleby, M. V., Chaplin, A. K., Beale, J. H., Sherrell, D. A., Duyvesteyn, H. M. E., Owada, S., Tono, K., Sugimoto, H., Strange, R. W., Worrall, J. A. R., Axford, D., Owen, R. L., Hough, M. A.
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Journal Title
IUCrJ
Volume: 6
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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