2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of synthetic light-controllable molecules to regulate the function of cellular membrane proteins
Publicly Offered Research
| Project Area | Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems |
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| Project/Area Number |
18H04537
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 光操作 / アップコンバージョン / GPCR / CRY2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜タンパク質受容体であるADRB2について，青色光依存的なタンパク質間相互作用誘起システムCRY2/CIBNを利用し，細胞内タンパク質Arrestinとの相互作用を誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることを実証した．さらに本原理を他のGPCRや１回膜貫通型タンパク質に適用可能であるかどうかを検証した．その結果，エンドサイトーシスを光誘起可能なグループ（A）とそうでないグループ（B）が存在することを発見した．グループAに属するバソプレシンV2受容体 (V2R) は，細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片 (V2RCT) のみでも細胞内で安定発現し，Arrestinとの相互作用を光誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることが確認された．さらに，V2RCTはエンドソーム形成後にリソソームへと移行し，分解されることが判明した．そこで，ペプチド断片V2RCTを他のGPCR (ADRA2A, mGluR1a) に付加した融合タンパク質を作成した．光照射によりArrestin-CRYとの相互作用を誘導したところ，多くの融合膜タンパク質がエンドサイトーシスされる様子が観察された．特にADRA2Aは本来エンドサイトーシスが光誘起されないグループBに属するGPCRであり，付加したペプチド断片V2RCTによってエンドサイトーシスが誘導されたことが判明した．平行してランタニドナノ粒子（LNP）の光操作を培養細胞を用いて検討した．アップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基板上で光制御システムを導入し，近赤外光レーザー (976 nm, CW) を照射し，青色光駆動光制御システムの駆動を検証した．近赤外光照射にともない，紫外光照射と同様のArrestinの膜以降とエンドサイトーシスが確認されたことから，LNPを用いることでCRY2の近赤外光操作が可能であることが解った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時に予定していた（Ｉ）膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子（LNP）により制御する技術については，概ね予定通りの成果を得ることに成功している．特に光操作タンパク質であるCRY2が，LNPの近赤外光照射により動作することが培養細胞レベルで確認することができた．この成果を基に，LNPを用いたCRY2の光操作が，既存の光操作ツールを含め可能となり，今後の大きな展開が期待できる成果である．課題（II）細胞膜レセプターのリサイクリング（エンドサイトーシスとエクソサイトーシス）を近赤外光により操作する技術では，バソプレシンV2受容体 (V2R)の細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片 (V2RCT)を，標的レセプターに連結することで，そのリサイクリングが青色光照射により可能であることを実証することができた．さらにLNPを分散させた培養ディッシュでは，近赤外光照射によりレセプターのリサイクリングを誘導することが可能となった．以上より研究はおおむね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
課題（Ｉ）膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子（LNP）により制御する技術については，LNPの表面修飾を行い，肝臓や脳への組織ターゲッティングを行う．また，LNP表面にLOV2を連結した粒子を作製し，光照射に伴う膜レセプターの凝集を実行可能にする．課題（II）細胞膜レセプターのリサイクリング（エンドサイトーシスとエクソサイトーシス）を近赤外光により操作する技術では，標的タンパク質となるEGFRのRepebodyをリアクティブタグで連結した架橋分子を作製する．そして，リサイクリング可能な膜タンパク質にリアクティブタグを反応させて，EGFRを細胞外から架橋できることを実証する．ここで細胞外から青色光照射した時，実際にEGFRがリサイクリング分子とともに，エンドサイトーシスが起こるかどうかを検証する．上手く動作しないときは，細胞膜上のリサイクリングタンパク質の発現量，光の照射タイミング，架橋反応などの条件検討を行い，効率よく内在性のEGFRがリサイクリングされることを立証する．
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